1 Центр досліджень продуктів харчування та розвитку, А. ІМОБІЛІЗАЦІЯ КИСЛОТИННИХ ПРОТЕАТІВ З ШЛУНКУ САРДИНИ МОНТЕРЕЙ (Sardinops sagax caerulea) В ПІДТРИМКАХ НА ОСНОВІ ХІТІНУ І ХІТОЗАНУ Автор: Хесус Аарон Салазар Лейва ТЕЗИ, Схвалені Координацією харчових технологій Херлоне

харчування

6 ПОСВІЩЕННЯ моїм батькам: Мануель Салазар Чавес (Q.E.P.D.) та Марія дель Росаріо Лейва Солорцано. Його чудовий приклад життя навчив мене завжди йти на більше. До своїх братів: Карлоса, Марісоль і Харіс. Якимсь чином кожен із вас вплинув і надихнув мене досягти своїх цілей і рухатися вперед. Спасибі брати. Моїм жінкам: Ідалії, Камілі та Софії. Вони - мій двигун і найбільше джерело натхнення. Я люблю їх. бачив

7 ЗМІСТ Сторінка КОНТЕКСТ. 1 РОЗДІЛ I. Огляд сучасного рівня досліджуваної теми 17 РОЗДІЛ II. Конструкція іммобілізованої біокаталітичної системи, що складається з кислотних протеаз, виділених із сардинних шлунків Монтерея (Sardinops sagax caerulea) та опор на основі хітину та хітозану, отриманих з голів креветок (Penaeus spp.) 40 РОЗДІЛ III. Отримання оптимальних умов іммобілізації протеаз сардинової кислоти Монтерея (Sardinops sagax caerulea) на частково деацетильованих підкладках хітину. 52 РОЗДІЛ IV. Біохімічна та операційна характеристика протеаз сардинової кислоти Монтерея (Sardinops sagax caerulea), іммобілізованих у частково деацетильованому хітині.79 ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ ТА ПЕРСПЕКТИВИ ДОСЛІДЖЕННЯ ПРИМІТКА: Сторінки розділів I та II відповідають розміщенню журналу, де вони публікували статті. vii

17, що використовується для проектування біокаталітичної системи, що складається з кислотних протеаз, виділених із сардинних шлунків Монтерея (Sardinops sagax caerulea), іммобілізованих на опорах на основі хітину та хітозану, отриманих з голів креветок (Penaeus spp.) 7

24 Глобальний звіт про ринок промислових ферментів: Видання за 2013 рік. Goycoolea, F., Agulló, E., & Mato, R. (2004). Джерела та процеси закупівель. У: А. Абрам Пастор, Хітин та Хітозан: отримання, характеристика та застосування Перу: Редакційний фонд Папського католицького університету Перу (П. ^ П. Гупта, Р., Бег, К., та Лоренц, П. (2002) Бактеріальні лужні протеази: молекулярні підходи та промислове застосування. Прикладна мікробіологія та біотехнологія, 59 (1), Haard, NF (1992). Огляд протеолітичних ферментів морських організмів та їх застосування в харчовій промисловості. Journal of Aquatic Food Product Technology, 1 (1), He, S., Franco, C., & Zhang, W. (2013). Функції, застосування та виробництво білкових гідролізатів із супутніх продуктів переробки риби (FPCP). Food Research International, 50 ( Honarkar, H., & Barikani, M. (2009). Застосування біополімерів I: хитозан. Monatshefte für Chemie-Chemical Monthly, 140 (12), Janec ek, S. t. (1993). Стратегії отримання стабільних ферменти. Біохімія процесу, 28 (7), Khor, E., & Lim, LY (2003). Імплантовані аплікації хітину та хітозану. Біоматеріали, 24 ( 13), Куріта, К. (2006). Хітин та хітозан: функціональні біополімери морських ракоподібних. Морська біотехнологія, 8 (3),

26 Рустад Т. (2003). Використання морських продуктів. Електронний журнал з питань хімії навколишнього середовища, сільського господарства та харчових продуктів (2). Rustad, T., Storrø, I., & Slizyte, R. (2011). Можливості утилізації морських побічних продуктів. Міжнародний журнал про харчові науки та технології, 46 (10), Шахіді, Ф., і Янак Каміл, Ю. (2001). Ферменти рибних та водних безхребетних та їх застосування в харчовій промисловості. Тенденції в галузі харчової науки та технологій, 12 (12), Sila, A., Nasri, R., Bougatef, A., & Nasri, M. (2012). Травні лужні протеази трави бичка (Zosterisessor ophiocephalus): Характеристика та потенційне застосування як миючої добавки та депротеїнізації відходів креветок. Journal of Aquatic Food Product Technology, 21 (2), Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., & Lee, J.-K. (2013). Від білкової інженерії до іммобілізації: перспективні стратегії модернізації промислових ферментів. Міжнародний журнал молекулярних наук, 14 (1), Turk, B. (2006). Орієнтація на протеази: успіхи, невдачі та перспективи в майбутньому. Огляди природи Відкриття наркотиків, 5 (9),

27 ГЛАВА I Використання матеріалів на основі хітину та хітозану для іммобілізації протеаз: вплив на їх стабілізацію та застосування Оглядова стаття прийнята до публікації в Мексиканському хімічному інженерному журналі 17

30 Salazar-Leyva et al./ Mexican Journal of Chemical Engineering, том 13, № 1 (2014) xxx-xxx Рис. 1. Методи іммобілізації ферментів, які найчастіше застосовуються сьогодні. З часом були розроблені різні методології іммобілізації ферментів. Однак важливо зазначити, що універсальної системи іммобілізації не існує, оскільки для даного випадку необхідно оцінювати різні методології в залежності від ферменту, який має бути іммобілізований, та процесу, в якому слід використовувати каталітичну систему. Хоча різні процеси іммобілізації концептуально відрізняються, можна сказати, що вони часто 3

50 РОЗДІЛ II Кислотні протеази із сардини Монтерей (Sardinops sagax caerulea), іммобілізованої на відходах креветок хітину та хитозану: Пошук каталітичної системи побічного продукту Стаття, опублікована в журналі Applied Biochemistry and Biotechnology 40

56 800 Appl Biochem Biotechnol (2013) 171: Суттєві відмінності засобів були встановлені на P 57 Appl Biochem Biotechnol (2013) 171: MWM Pepsin II Fig. 1 Ферментний екстракт SDS-PAGE. Рядок 1, маркери молекулярної маси (MWM). Лінія 2, напівочищений кислотний екстракт протеаз із сардинових шлунків Монтерей Адсорбція білка на носіях Щодо ПА, всі дослідження показали значення більше 65%. Спостерігали максимум% для CHSF та% для опор для іммобілізації PDCHNF, активованих 0,2% геніпіном (ковалентна іммобілізація) (Р 0,05) (Таблиця 2). Згідно з літературою, можливості адсорбувати білок за допомогою різних носіїв, що використовуються в цьому дослідженні, були прийнятними. Попереднє дослідження повідомляло, що намистини хітозану, зшиті з ГА, адсорбували 72% доступної протеази [26]. Тим часом, коли папаїн з'єднувався з гідрогелями хітозану, активованими GA, було отримано лише 15,3% адсорбції ферментів [27]. Інші дослідження повідомляли про нижчі значення адсорбції білка (35%), коли ліпазу з Candida rugosa іммобілізовали на гранулах хітозану, активовану 0,3% (p/v) 120 Активність ферменту (%) ph Рис. 2 Вплив ph на активність ферменту екстракту напівочищених кислих протеаз із сардини Монтерей (S. sagax caerulea)

62 РОЗДІЛ III Оптимальна іммобілізація кислих протеаз із сардини Монтерея (Sardinops sagax caeurelea) на частково деацетильованому хітині з відходів голови креветок Рукопис, підготовлений для подання до Journal of Aquatic and Food Product Technology 52

63 Оптимальна іммобілізація кислих протеаз із сардини Монтерея (Sardinops sagax caeurelea) на частково деацетильованому хітині з відходів голови креветок. Еліса Міріам Валенсуела-Сото а, Йосафат Марина Езкерра-Брауер б, Франсіско Хав'єр Кастільо-Яньєс б та Рамон Пачеко-Агілар a * a Центр досліджень у галузі харчових продуктів та розвитку AC Carretera a la Victoria, C.P Hermosillo, Сонора, Мексика. b Департамент досліджень та аспірантури з харчових продуктів Університету Сонори. Rosales y Niños Héroes S/N. Ермосільо, Сонора, Мексика. * Автор-кореспондент: Рамон Пачеко-Агілар Тел./Факс: адреса: 53

81 Таранафан, Р. та Кіттур, Ф. Хітин - безперечна біомолекула великого потенціалу. Крит. Rev. Food Sci. Nutr. 43: Tripathi, P. Kumari, A. Rath, P. and Kayastha, A. M Іммобілізація α-амілази з квасолі маш (Vigna radiata) на бурштині Amberlite MB 150 та хітозані: Порівняльне дослідження. J. Mol. Катал. B-фермент. 49:

82 Таблиця 1 Оцінені коефіцієнти та їх закодовані та фактичні значення, що використовуються в центральній композитній конструкції Фактор Високий осьовий (+ α) Високий факторіальний (+1) Центр (0) Низький факторіальний (-1) Низький осьовий Ферментне навантаження, мг/мл (X 1) ph іммобілізації (X 2) STPP,% (X 3) (-α) 72

83 Таблиця 2 Виділення кислих протеаз із шлунків сардини Монтерея (Sardinops sagax caerulea) Крок виділення Загальний білок (мг) Загальна активність (U) a Питома активність (U/мг) Збільшення чистоти Сирий екстракт (NH 4) 2 SO 4 20% (NH 4) 2 SO 4 70% Діалізований екстракт U = 1 мкг еквівалента тирозину, що виділяється з гемоглобіну за хв. 73

84 Таблиця 3 Хімічний склад (суха маса) відходів голови креветок та екстрагованого хітину Зразок ліпідів Загальний зольний білок Хітин азот Голова креветок 4,3 ± ± ± ± ± 0,1 відходів Хітин 0,56 ± ± ± ±

85 Таблиця 4 Розрахункова матриця та експериментальні значення оціненої відповіді Фактори запуску Відповідь Навантаження ферменту, мг/мл (X 1) ph іммобілізації (X 2) STPP,% (X 3) Вихід іммобілізації (%)

86 Вихід іммобілізації (%) Навантаження ферменту (мг/мл) a Вихід іммобілізації (%) Імобілізація ph b Вихід іммобілізації (%) STPP (%) c Рисунок 1. Вплив різних параметрів на вихід іммобілізації сардинних протеаз (a) Навантаження ферменту (b) ph іммобілізації та (c) концентрація триполіфосфату натрію (STPP) 76

87 Таблиця 5 Дисперсійний аналіз (ANOVA) для вбудованої квадратичної моделі для оптимізації виходу іммобілізації Джерело Ступінь свободи Значення F-значення P (Prob> F) Модель * Навантаження ферменту, мг/мл (X 1) * Іммобілізація ph ( X 2) STPP,% (X 3) X 1 * XX 1 * XX 1 * XX 2 * X * X 3 * X Відсутність придатності RR 2 adj 0,71 * Значуще при значенні P менше, ніж

88 a b c Рисунок2. Діаграми поверхні реакції на взаємний вплив умов іммобілізації на вихід іммобілізації. (a) завантаження ферменту та іммобілізація ph, (b) завантаження ферменту та концентрація триполіфосфату, (c) ph завантаження та концентрація триполіфосфату 78