ДИПЛОМНА ТЕЗА Жолт Габор Надь, магістерська програма з питань харчування 2012

габор

Університет Земмельвейса, Факультет наук про здоров’я та Університет Корвінуса в Будапешті, Факультет харчових наук Дослідження забруднення глютеном харчових продуктів, які можуть вживати люди, чутливі до глютену, та порівняння методів вимірювання вмісту глютену Zsolt Gábor Nagy Доцент, магістр харчових продуктів 2012, керівник: Доктор В

Зміст Зміст. 2 Реферат. 4 1. Вступ. 6 2. Огляд літератури. 8 2.1 Вступ до глютену. 8 2.2 Вступ до целіакії (чутливість до глютену). 11 2.2.1 Епідеміологія захворювання. 11 2.2.2 Патомеханізм целіакії. 12 2.2.3 Виявлення целіакії. 15 2.3 Правове регулювання вмісту клейковини. 16 2.4 Еволюція методів визначення вмісту клейковини. 21 2.4.1 Вимоги до методів вимірювання. 21 2.4.2 Фактори, що впливають на вимірювання. 21 2.4.3 Мікроскопічний метод. 22 2.4.4 Електрофоретичні методи. 23 2.4.5 Хроматографічний метод. 24 2.4.6 Імунологічні методи. 28 2.4.7 Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР). 33 2

3. Незалежне дослідження забруднення клейковини. 35 3.1 Мета дослідження. 35 3.2 Предмет дослідження. 35 3.3 Гіпотези. 35 3.4 Презентація методу визначення Ѡ-гліадину. 36 3.5 Вступ до методу R5. 40 3.6 Презентація вибірки. 45 4. Результати. 46 4.1 Зміни кольору на мікропланшеті. 46 4.2 Порівняння методів TEPNEL та R5. 47 4.3 Забруднення клейковини вівсяними продуктами. 49 4.4 Забруднення глютеном борошна. 50 4.5 Забруднення глютеном харчових продуктів для певних харчових потреб. 52 4.6 Забруднення клейковини органічними продуктами. 53 5. Обговорення. 54 6. Висновки та рекомендації. 57 Резюме. 62 Список літератури. 63 Подяка. 68 Стаття. 69 Додатки. 3

2. Огляд літератури 2.1 Введення клейковини Продукти, виготовлені із круп (пшениця, ячмінь, жито, овес), є основою споживання угорської їжі. З систематичної точки зору рослин, злаки належать до трав і мають багато споріднених гілок (рис. 1). Через своє спільне походження ці споріднені види в чомусь ідентичні та відрізняються за певними характеристиками. З рисунка видно, що соки пшениці, жита, ячменю та тритикале належать до систематичної групи. Це підтверджується складом їх білків, їх подібними властивостями. У міру відходу від цієї таксономічної групи (наприклад, рису) склад і алергенність рослинних білків змінюються (Takács, 2008). Рисунок 1: Дерево спорідненості для злакових та псевдозернових культур (Takács, 2008) Пшениця є найбільш широко вирощуваною злаковою продукцією в угорському сільському господарстві. Будова ока різноманітна, основними частинами є ендосперм, стінка плода, зародок (рис. 2). 8

Рисунок 2: Поздовжній розріз зерна пшениці (Tímár & Matuz, 1996) Ендосперм становить 82-86% маси зерна пшениці. Ця частина важлива, оскільки тут формуються і зберігаються білки, які негайно утилізуються і зберігаються між гранулами крохмалю. Білки ендосперму вперше класифікував Осборн на основі їх розчинності (Osborne, 1907): водорозчинні білки: альбуміни, солерозчинні білки: глобуліни, розчинні в спирті білки: гліадини, білки, розчинні у кислотах та лугах: глютеніни З цих білків, глютен і клейковина разом). Ця молекула полімеру має унікальні структурні властивості: тіолові та сульфідні містки запобігають відтоку крохмалю з білкової основи навіть у періоди посухи та теплового стресу. Це має велике значення з точки зору випікання: якщо клейковина потрапляє у вологу, створюється зшита полімерна структура, яка не дозволяє газовим бульбашкам, що утворюються дріжджами, проходити наскрізь і, отже, хліб піднімається. Білки глютену можна додатково згрупувати аналітичними методами. На малюнку 3 показані результати диференціації звичайними та молекулярними методами. 9

Рисунок 3: Порівняння традиційної (функціональної) та нової (молекулярної) класифікацій білків клейковини (Shewry, Tatham, Forde, Kreis, Miflin, 1986) За допомогою звичайного методу (вивчення функціональності) можна виділити наступні групи: Мономерні гліадини (Ѡ -гліадини, альфа-гліадини, Ƴ-гліадини) Агреговані глютеніни (низькомолекулярні субодиниці, субодиниці з високою молекулярною масою) На підставі вивчення молекулярного складу члени цих груп можна розділити на інші групи: Проламіни, бідні сіркою: Ѡ-гліадіни Гамініни, багаті сіркою, альфа-гініни:, низькомолекулярні субодиниці Високомолекулярні проламіни: високомолекулярні суб'єдини типовий проламін у кукурудзяному зеїні (Tímár & Matuz, 1996). Підводячи підсумок, клейковина - це білкова фракція, одержувана з пшениці, жита, ячменю, вівса та їхніх схрещених порід, та їх похідних, що не переноситься певними особами і яка не розчиняється у воді та 0,5 М розчині хлориду натрію. 10

Угорщина: 1:80 (діти) Італія: 1: 100 1: 300 (діти) Швеція: 1: 285 (діти) та 1: 500 (дорослі) Норвегія: 1: 285 (дорослі) Ірландія: 1: 300 (дорослі) Північна Ірландія: 1: 122 (дорослі) Хорватія: 1: 520 (діти) 2.2.2 Патомеханізм целіакії Клейковина, потрапляючи в шлунково-кишковий тракт під час целіакії, індукує аутоімунні процеси в тонкому кишечнику, що призводить до атрофії слизових оболонок та ворсинок кишечника (Малюнок 4).). Структура пуху сплющується, крипти подовжуються, збільшуються, а мітотична активність посилюється в їх клітинах (рис. 5). Поверхневий епітелій також вирівнюється і ферментативна активність знижується. Рисунок 4: Результати ендоскопічної та біопсійної терапії у здорових людей (A, B) та целіакії (C, D). (JOHN PRESUTTI et al, 2007) 12

Малюнок 5: Поверхня ворсинок кишечника здорової людини А та поверхня ворсинок кишечника пацієнта В, чутливого до глютену (Людвіг, 2002) Внутрішньоепітеліальні лімфоцити проліферують з подальшою активацією Т-клітин. Глютеноутворюючий гліадин, потрапляючи в організм, зв’язується з тканинною трансглютаміназою (кальцієзалежним ферментом, активним у цитозолі) в тонкому кишечнику. Тканинна трансглутаміназа дезамінує гліадинові пептиди, в результаті чого утворюються пептидні епітопи (з якими також може зв'язуватися білок HLA-DQ2). Щойно утворений комплекс ініціює вироблення аутоантитіл, керованих CD4 + Т-клітинами, що призводить до вироблення антитіл проти власних клітин організму, тим самим руйнуючи секрецію тонких кишкових ворсин. Погіршення всмоктування призводить до порушення функціонування та дефіциту в деяких частинах тіла. 13

2.2.3 Виявлення целіакії Розпізнавання і виявлення целіакії є результатом багатоетапного процесу. 1. Розпізнати симптоми захворювання 2. Виявлення антитіл в організмі (IgA EMA, ttg) 3. Біопсія тонкої кишки У світлі проведених тестів целіакія є ймовірною, якщо присутні принаймні 3 з наведеного нижче (Korponay-Szabó, 2008): дієта без глютену покращує клінічні симптоми позитивність антитіл до ендомізію або трансглутамінази наявність наявності запалення HLA-DQ2 або HLA-DQ8 у тонкому кишечнику, що характеризується підвищеною кількістю інтраепітеліальних лімфоцитів 3 типи целіакії: a існує, але пацієнт протікає безсимптомно. EMA/ttg може показати позитивний результат (серопозитивність), але відсутність атрофії грудочки. тиха целіакія: серопозитивність та атрофія грудочок існують, але пацієнт протікає безсимптомно. Однак можна виявити дефіцит заліза, анемію, остеопороз. активна целіакія: важка когортна атрофія, високий титр серопозитивності та типові/атипові клінічні симптоми. 15

надлишок глютену в їжі, що продається кінцевому споживачеві. овес, що міститься в ньому, спеціально готується, готується та/або обробляється таким чином, щоб уникнути забруднення їх пшеницею, житом, ячменем або їх різновидами, а вміст клейковини в такому вівсі не повинен перевищувати 20 мг/кг. 2. Термін "дуже низький вміст клейковини" може з'являтися на упаковці або маркуванні продукту, якщо він містить або складається з одного або декількох інгредієнтів, виготовлених із пшениці, жита, ячменю, вівса або їх змішаних порід, отриманих спеціальним способом для отримання зменшують вміст глютену. були зменшені і не містять більше 100 мг/кг клейковини в їжі, що продається кінцевому споживачеві. Закони та директиви, прийняті Європейським Союзом, постійно включаються в угорську правову систему під час гармонізації угорського законодавства та правової системи. 20