предметів

реферат

Мікроглія представляє раціональні, але складні цілі щодо поліпшення цілісності білої речовини завдяки їх дуалістичним захисним і токсичним завданням. У цьому дослідженні досліджується вплив поліненасичених жирних кислот Омега-3 (n-3 PUFA) на мікрогліальну реакцію на патологію мієліну в первинних культурах та на моделі розсіяного склерозу (РС), руйнівного демієлінізуючого захворювання. Докозагексаєнова кислота (DHA) та ейкозапентаенова кислота (EPA), дві основні форми n-3 PUFA у мозку, стримували вивільнення оксиду азоту та фактора некрозу пухлини-α з первинної мікроглії при стимуляції IFN-γ та мієліном. DHA та EPA також посилювали фагоцитоз мієліну in vitro. Отже, n-3 ПНЖК можуть інгібувати запалення, одночасно стимулюючи корисні імунні реакції, такі як мікрогліальний фагоцитоз. Дослідження in vivo показали, що добавки PU-n-3 PUFA зменшують демієлінізацію, спричинену вадами, і покращують рухову та когнітивну функції. Позитивні ефекти n-3 PUFA супроводжувались зміщенням мікрогліальної поляризації у бік корисного фенотипу M2 in vitro та in vivo. Ці результати свідчать про те, що n-3 ПНЖК можуть бути клінічно корисними як імуномодулюючі засоби для демієлінізуючих захворювань завдяки новому механізму, що включає переключення мікрогліального фенотипу.

Залежно від навколишнього середовища мікроглії розрізняються за своїм фенотипом. Хоча «класично активований» фенотип M1 пов’язаний із підвищеною презентацією антигену та виробленням токсичних цитокінів та активних форм кисню, «альтернативно активований» фенотип M2 стосується очищення клітинних уламків, локального вирішення запалення та вивільнення. трофічні фактори, що сприяють регенерації після неврологічних пошкоджень 5, 6. Відомо, що на поляризацію фенотипу впливає прогресування багатьох неврологічних захворювань, включаючи MS 7, інсульт 8, черепно-мозкову травму 9 та пошкодження спинного мозку 10, 11, і тому може представляти потенційну терапевтичну мішень для неврологічних розладів.

Поліненасичені жирні кислоти омега-3 (n-3 ПНЖК) вивчали щодо їх сприятливого впливу на багатьох моделях нейродегенеративних захворювань тварин, таких як хвороба Альцгеймера 12, 13, 14 та хвороба Паркінсона 15. Відомо кілька механізмів, що лежать в основі нейропротекції, опосередкованої n-3 PUFA, такі як придушення клітинної загибелі, пригнічення запалення та сприяння нейрогенезу. Недавні дослідження також досліджували вплив n-3 PUFA на патологію білої речовини. Наприклад, добавки PU-n-3 PUFA асоціюються з меншою кількістю уражень білої речовини та покращенням функціональних можливостей у літніх людей 16, 17. Крім того, кілька епідеміологічних досліджень вказують на те, що добавки ПНЖК n-3 пов'язані з поліпшенням клінічних результатів у пацієнтів із РС 18, 19. Сприятливі ефекти добавки n-3 PUFA також були описані в експериментальній моделі тварин на МС з експериментальним аутоімунним енцефаломієлітом (EAE) і пояснюються модулюючим впливом докозагексаєнової кислоти (DHA) на активацію дендритних клітин Т-клітин 20. Однак вплив n-3 PUFA на мікроглію відповіді при РС чи іншій патології білої речовини не досліджували.

У цьому дослідженні ми використовували первинні мікрогліальні культури та тваринну модель демієлінізації, спричинену незначним впливом n-3 PUFA на мікрогліальну реакцію на патологію мієліну. Ми виявили, що DHA та ейкозапентаенова кислота (EPA), основний ПНЖК n-3 у центральній нервовій системі, інгібують залежно від концентрації мікрогліальне вивільнення медіаторів запалення у відповідь на стимуляцію мієліну та IFN-γ та посилюють фагоцитоз мієліну. в пробірці. Подальші дослідження механізму показали, що DHA та EPA можуть зміщувати мікрогліальну поляризацію до фенотипу M2 за фізіологічних умов in vitro та інгібувати поляризацію M1 при запальних станах. Дослідження in vivo також підтверджують, що доповнення n-3 PUFA зменшує демієлінізацію, викликану незначним ефектом, і покращує рухові та когнітивні здібності. Ці сприятливі ефекти n-3 PUFA на тваринній моделі також супроводжувались переходом до мікрогліального фенотипу M2 in vivo .

результат

DHA та EPA інгібують запальні реакції при мікроглії

Щоб визначити, чи можуть DHA та EPA модулювати активацію мікроглії, первинні мікроглії обробляли DHA або EPA протягом 24 годин, а потім стимуляцію LPS (2,5 нг/мл) протягом наступних 24 годин. Виділення оксиду азоту (NO) та TNFα у культуральному середовищі вимірюють як маркери запальної реакції. Як показано на малюнку 1, попередня обробка DHA значно послабила вивільнення NO та TNFα, спричинене LPS, залежно від концентрації, починаючи з 20 мкМ (малюнки 1A та 1D). Ефект EPA був якісно подібним до ефекту DHA (малюнки 1B та 1E). Потім у більшості наступних експериментів використовували найнижчі концентрації DHA (20 мкМ) та EPA (20 мкМ), які успішно інгібували вивільнення NO і TNFα. Придушення вироблення NO та TNFα не можна пояснити клітинною токсичністю, пов'язаною з DHA та EPA, оскільки ні DHA, ні EPA не збільшували позаклітинного вивільнення LDH у середовищі (рис. 1C та 1F).

користь

(A - F) Первинні мікроглії, посіяні при 5 х 10 4/лунку, попередньо обробляли різними концентраціями DHA або EPA (5-80 мкМ) протягом 24 годин з подальшою стимуляцією LPS (2,5 нг/мл). Живильне середовище збирали через 24 години після LPS. Виробництво оксиду азоту (NO) (A, D) та фактора некрозу пухлини-α (TNF-α) (B, E) вимірювали як маркери запалення. Виробництво лактатдегідрогенази (ЛДГ) (C, F) вимірювали як аналіз загибелі клітин. (G - J) Первинні мікроглії, посіяні при 5 х 104/лунку, попередньо обробляли DHA (20 мкМ) або ЕРА (20 мкМ) протягом 24 годин, а потім мієліном (1, 5 або 10 мкг/мл) з IFN- або без нього стимуляція γ (5 нг/мл) протягом ще 24 годин. Позаклітинний NO (G, I) та TNF-α (H, J) вимірювали в культуральному середовищі. Результати виражаються як середнє значення ± SEM трьох-чотирьох незалежних експериментів, кожен виконаний у трьох примірниках. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 порівняно з обробкою транспортного засобу.

Повнорозмірне зображення

Ми також підтвердили інгібуючий ефект DHA та EPA на запальні мікрогліальні реакції на моделі in vitro, пов’язаній із захворюванням, використовуючи мієлін та IFNγ як стимулятори запалення. Хоча окремі активуючі фактори викликали лише слабку мікрогліальну відповідь, спільне лікування мієліном та IFNγ показало сильний синергетичний та залежний від концентрації вплив на маркери запалення у мікроглії (рис. 1G-J). Крім того, попередня обробка DHA (20 мкМ) або EPA (20 мкМ) суттєво зменшила вироблення NO (індукованого мієліном + IFNγ) (Малюнки 1G та 1I) та TNFα (Малюнки 1H та 1J). Ці дані настійно свідчать про те, що n-3 PUFAs пригнічують мікрогліальну реакцію на пов'язані з РС запальні подразники. Крім того, EPA, мабуть, має дещо більший протизапальний ефект.

DHA та EPA посилюють фагоцитоз мієліну при мікроглії

Щоб вивчити вплив n-3 PUFA на фагоцитоз мієліну, мікроглію інкубували з різними концентраціями DHA або EPA в діапазоні від 5 мкМ до 80 мкМ протягом 24 годин. Мічений мікроб міеліном додавали до культур ще протягом 6 годин. Після промивання фагоцитоз мієліну визначали кількісно, ​​вимірюючи флуоресценцію Cy3 у клітинному лізаті. Лікування DHA (малюнок 2A) або EPA (малюнок 2B) при концентраціях 10-40 мкМ значно збільшувало фагоцитоз мієліну. Конфокальна візуалізація підтвердила, що лікування DHA (20 мкМ) - або EPA (20 мкМ) збільшує мікрогліальний фагоцитоз (малюнки 2C).

Первинні мікроглії попередньо обробляли різними концентраціями DHA або EPA (5-80 мкМ) протягом 24 годин з наступною інкубацією з міченим Cy3 мієліном (0,5 мкг/мл) протягом ще 6 годин. (A, B) Фагоцитоз мієліну визначався кількісно як внутрішньоклітинна флуоресценція. (В) Репрезентативні зображення, що показують, що лікування ДГК (20 мкМ) або ЕРА (20 мкМ) збільшує фагоцитоз мієліну. Результати виражаються як середнє значення ± SEM трьох-чотирьох незалежних експериментів, кожен виконаний у трьох примірниках. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 порівняно з обробкою транспортного засобу.

Повнорозмірне зображення

DHA та EPA модулюють мікрогліальну поляризацію у фізіологічних та запальних станах

Як згадувалось у вступі, мікроглія, як відомо, займає різні фенотипи, такі як M1 і M2, у відповідь на різні зовнішні подразники 10, 21. Тому ми використовували високопродуктивне ПЛР-поле для аналізу експресії множинних сигнальних генів M1 та M2 у мікрогліях, оброблених DHA або EPA. Як DHA, так і EPA продемонстрували дивовижні тенденції до збільшення регуляції генів M2 та зменшення генів M1 у фізіологічних умовах (Рисунок 3A - 3B).

Первинні мікроглії, інокульовані 5 × 10 4/лункою в 6-лункову платівку, попередньо обробляли DHA або EPA (по 20 мкМ кожна) протягом 24 годин. (A-B) ПЛР у режимі реального часу показують, що лікування DHA (A) та EPA (B) суттєво пригнічувало експресію безлічі генів M1 та покращувало експресію генів M2. (C-F) ПЛР у реальному часі показала значну стимуляцію пов'язаного з M2 гена CD206 (C) та TGFβ (D) після лікування DHA або EPA. Крім того, попередня обробка DHA або EPA суттєво пригнічувала експресію M1-пов'язаних генів TNF-α (E) та iNOS (F) після стимуляції LPS (2,5 нг/мл) протягом 24 годин. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 проти контролю; P = 0,01, ## P = 0,001 проти LPS.

Повнорозмірне зображення

Ми також використовували звичайну ПЛР у режимі реального часу, щоб перевірити вплив DHA та EPA на мікрогліальну поляризацію. Первинні мікроглії обробляли DHA (20 мкМ) або EPA (20 мкМ) протягом 24 годин. Відповідно до даних польових методів ПЛР, лікування DHA та EPA суттєво підвищувало експресію CD206 та/або TGFβ, двох репрезентативних генів M2, у фізіологічних умовах (Фігура 3C-3D). Лікування DHA або EPA не пригнічувало експресію TNFα та iNOS, двох репрезентативних генів M1, у фізіологічних умовах, але суттєво зменшувало вироблення цих двох генів запалення після стимуляції LPS протягом 24 годин (рис. 3E та 3F). Ці дані свідчать про те, що DHA та EPA можуть модулювати фенотипову поляризацію мікроглії як у фізіологічних, так і в патологічних умовах.

Добавки PU-n-3 PUFA зменшують демієлінізацію у мишачої моделі РС

Мишей годували дієтою, що містить 0,2% купризону з (N3H) з або без збагачення (N3L) n-3 PUFA протягом 5 тижнів. (A) Демієлінізуючі ураження мозолистого тіла (CC) були виявлені за допомогою фарбування Luxol fast blue (LFB) (ліворуч), забарвлення MBP та електронної мікроскопії (EM, праворуч). Патологічні зміни аксонів були виявлені шляхом імуномаркірування SMI32. Зображення представляють розділи чотирьох тварин. (B) Інтенсивність MBP вимірювали та обчислювали як зміну складки порівняно із змодельованим значенням. (C) Співвідношення SMI32 до MBP розраховували як показник пошкодження білої речовини (пошкодження аксонів та демієлінізація). (D) Вестерн-блот-аналіз експресії MBP. n = 4 миші для кожної групи. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 порівняно із модельованими контролями.

Повнорозмірне зображення

Добавки PU-n-3 PUFA зменшують неврологічні дефіцити поведінки в моделі демієлінізації, обробленої купризоном

Мишей годували дієтою, що містить 0,2% купризону з (N3H) із або без (N3L) збагачення n-3 PUFA протягом 5 тижнів. (А - С) Тест на водний лабіринт Морріса проводили через 28-32 дні після початку дієти з купризоном. (А) Репрезентативні зображення плаваючих шляхів мишей у кожній групі, коли платформа була присутня (навігація на місці; фаза навчання) та після її видалення (тест зонду; фаза пам’яті). (B) Латентність локалізації платформи занурення вимірювали у n-3 PUFA та регулярних дієтичних мишей через 28 - 31 день після початку дієти з купризоном. (C) Просторову пам’ять про місце розташування раніше зануреної платформи вимірювали у мишей, що додавали n-3 PUFA, та регулярних дієт через 32 дні після початку дієти з купризоном. Просторова пам’ять виражається як час перебування в цільовому квадранті, коли платформа була вилучена. (D) Тест Ротарода до та після 2-5 тижнів лікування кальризоном. n = 8 тварин/група. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 для наведених порівнянь.

Повнорозмірне зображення

Добавки PU-n-3 PUFA сприяють поляризації мікроглії М2 на тваринній моделі демієлінізації, обробленої купризоном

Щоб дослідити вплив n-3 PUFA на поляризацію мікроглії в моделі демієлінізуючої хвороби in vivo, ми виміряли експресію серії сигнальних генів M1 та M2 методом RT-PCR. Як і очікувалося, експресія генів M1 (CD16 та iNOS) значно збільшилася через 5 тижнів дієти купризону. Добавки PU-n-3 PUFA стримували збільшення цих генів M1 (Фігура 6B) та збільшували експресію трьох генів M2 (CD206, YM1/2 та Arg1, Фігура 6A) у мишей, оброблених купризоном. Імунофлуоресцентне фарбування додатково показало, що експресія маркерних білків M1 (CD16) та M2 (CD206) збільшувалась після 5 тижнів дієти купризону (Фігура 6C-F). Добавки n-3 PUFA змістили мікрогліальну поляризацію до М2 у цій моделі, як показано збільшенням експресії CD206 та інгібуванням експресії CD16 у мозолистому тілі.

Мишей годували дієтою, що містить 0,2% купризону з (N3H) із або без (N3L) збагачення n-3 PUFA протягом 5 тижнів. (A-B) ПЛР у режимі реального часу для маркерів M1 (A) та маркерів M2 (B) проводили із застосуванням загальної РНК, вилученої з мозолистого тіла. (C) Репрезентативне імунофлюоресцентне фарбування Iba1 CD20/32 (M1) або CD206 (M2) у мозолистому тілі. Шкала: 40 мкм. (D - F) Кількісне визначення клітин Iba1 + (D), CD16/32 + (E) та CD206 + (F) у мозолистому тілі. n = 4 тварини на групу. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 проти моделювання; #P ≤ 0, 05, ## P ≤ 0, 01, ### P ≤ 0, 001 проти CPZ + N3L.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Результати, представлені в цьому документі, демонструють сильний сприятливий вплив DHA та EPA на мікрогліальну реакцію на патологію мієліну. Здатність n-3 PUFA інгібувати запалення, одночасно посилюючи фагоцитоз в мікроглії, стимульованій мієліном, демонструє нові нові можливості для лікування неврологічних захворювань. Крім того, знаходження зсуву від M1 до M2 свідчить про сприятливу модуляцію фенотипу мікроглії n-3 PUFA.

Про протизапальну дію DHA та EPA повідомлялося при різних нейродегенеративних захворюваннях, включаючи інсульт та хворобу Альцгеймера 24, 25, 26, 27, 28, 29. Також було показано, що ПНЖК N-3 збільшують мікрогліальний фагоцитоз амілоїду-β на моделі in vitro AD 30. Однак ролі DHA та EPA у поляризації мікроглії та патології РС раніше не досліджувались; це дослідження є першим, що вивчає роль n-3 ПНЖК у мікрогліальній поляризації в моделі, пов’язаній з демієлінізуючою хворобою. Ми виявили, що n-3 ПНЖК мають сприятливий вплив на функцію мікроглії шляхом диференціального інгібування мієліну та IFN-γ-індукованого запалення та посилення фагоцитозу мієліну. Ці функціональні ефекти були пов'язані з мікрогліальною поляризацією щодо домінуючого фенотипу М2. Фенотипова поляризація може сприяти мікросередовищу, яке протистоїть запальним пошкодженням і подальшій демієлінізації при РС, що призводить до поліпшення неврологічної функції in vivo .

Деякі дослідження припускають, що ендогенний зсув від мікрогліального фенотипу М1 до М2 відбувається на початку ремієлінізації в моделях MS 6. Крім того, вибіркове виснаження фенотипових клітин М1 або М2 показало, що воно сприяє фенотипу М2, тоді як фенотип М1 погіршує регенерацію олігодендроцитів у цій моделі 6. Тому цілком можливо, що поляризація M2, забезпечена n-3 PUFA, може не тільки зменшити демієлінізацію, як показано в цьому дослідженні, але й принести користь процесу ремієлінізації при РС. Тому поточні дослідження в нашій лабораторії досліджують вплив n-3 ПНЖК на диференціювання та ремієлінізацію олігодендроцитів.

На додаток до сприятливого впливу на мікрогліальну поляризацію, наше недавнє дослідження також продемонструвало прямий захисний ефект DHA проти екситотоксичності в олігодендроцитах 31. Таким чином, як прямий (через олігодендроцити), так і непрямий (через мікроглію) механізми можуть сприяти захисту n-3 PUFA-білої речовини. Цікаво, що оптимальна доза DHA для протизапального ефекту при мікроглії та захисного ефекту в олігодендроцитах становить приблизно 20 мкМ 31. DHA або EPA у подібному діапазоні доз також пригнічує запалення в Т-хелперних клітинах людини та збільшує секрецію протизапальних факторів з моноцитів 32. Крім того, дослідження на тваринах підтвердило, що добавки DHA можуть значно підвищити рівень DHA в мозку приблизно до 10-20 мкМ/г вологої тканини мозку протягом декількох тижнів 33. Через їх здатність орієнтуватись на кілька типів клітин та легкість прийому їжі, n-3 ПНЖК слід додатково досліджувати як терапевтичний засіб для пацієнтів з РС. Якщо DHA та EPA зможуть викликати подібні захисні ефекти у людей, ці природні сполуки слугуватимуть безпечним та недорогим засобом для 2,3 мільйона людей у ​​всьому світі, які страждають на РС, а також незліченних інших пацієнтів з демієлінізуючими захворюваннями.

методи

Культури, збагачені первинною мікроглією

Первинні збагачені мікроглією культури готували з цілого мозку 1-денних цуценят, як описано вище 34. Коротко кажучи, тканини мозку розтиралися після видалення мозкових оболонок та судин. Потім клітини висівали в культуральну колбу 5 × 10 7 клітин/150 см 3 у середовищі DMEM/F12, що містить 10% інактивованої теплом фетальної бичачої сироватки, 2 мМ L-глутаміну, 1 мМ пірувату натрію, 100 мкМ несуттєвого аміно кислоти. U/мл пеніциліну та 50 мкг/мл стрептоміцину. Після досягнення злитого моношару гліальних клітин (як правило, протягом 12-14 днів після первинного посіву) мікроглії збирали, збирали та резекували. Культури мікроглії (чистота 97%) потім обробляли DHA або EPA (Sigma, Сент-Луїс, Місурі), розчинені в середовищі протягом 24 годин, а потім додаткові концентрації мієліну та IFN-γ протягом додаткових 24 годин.

Приготування мієліну

Мієлін виділяли з мозку 3-місячних мишей центрифугуванням з градієнтом щільності сахарози (0,32 М та 0,85 М) при 75000 х г, як описано вище 35. Вміст мієлінового білка визначали за допомогою тесту Бредфорда (Bio-Rad) з бичачим сироватковим альбуміном як стандарт. Концентрація ендотоксинів у залишках мієліну становила