реферат
Головний
Більшість опублікованих досліджень аналізували лише один або два гени або продукти генів при стеатозі печінки або NASH, і тому не продемонстрували потенційного молекулярного різноманіття цієї часто спостерігається гістологічної особливості печінки. Останні досягнення в технології мікрочипів та біоінформатики показали молекулярну неоднорідність на основі профілів експресії генів у всьому геномі. Опубліковані нещодавно дані мікрочипів показали значні відмінності у експресії генів, важливих для підтримання функції мітохондрій між пацієнтами NASH та здоровими особами. 13 Тут ми порівняли рівні мРНК у геномах нормальної печінки та жирової печінки без гістологічних ознак запалення, щоб покращити наше розуміння фізіопатогенезу стеатозу як такого. .
Матеріали і методи
Зразки пацієнта та тканин
Стіл в натуральну величину
Гістологічний аналіз біоптатів печінки людини проводили два незалежні патологи. Ступінь стеатозу визначали як 1, коли вакуолі ліпідів мали менше 30% гепатоцитів та 2, коли вакуолі ліпідів мали 30–60% гепатоцитів. Були розглянуті дві групи біопсій печінки: перша група складалася з дев'яти біоптатів печінки без гістологічних ознак стеатозу або запалення; друга група складалася з дев'яти біоптатів печінки зі стеатозом 1 (n = 5) та ступеня 2 (n = 4). Жодна з використовуваних печінок не виявляла фіброзу, тільців або цирозу. Середній ІМТ становив 26,5 ± 4,3 кг/м2 у групі стеатозу та 22,7 ± 3,0 кг/м2 у пацієнтів без стеатозу (Р 16, 17, 18. Ця процедура враховує загальний розподіл статистичних даних тестів і використовує повторну вибірку (наприклад, Bootstrap або перестановка) для оцінки цього розподілу.
Аналіз даних проводився за допомогою програмного забезпечення з відкритим кодом R, версія 1.9.0. (CRAN, www.cran.r-project.org). Функція hclust із пакету статистики була використана для ієрархічної кластеризації. Були використані наступні пакети проектів Bioconductor (www.bioconductor.org 19): affy 20 для попередньої обробки даних, multtest 21 для ідентифікації диференційовано виражених послідовностей та анафія для анотації генів.
Кількісна RT-PCR
Стіл в натуральну величину
Кількісна оцінка MtDNA
Ми кількісно визначили мітохондріальну ДНК (mtDNA) у загальній кількості ДНК, вилученої з кожної біопсії печінки із (n = 20) та без (n = 20) стеатозом, використовуючи описаний вище метод. Коротко кажучи, ядерний ген (β-актиновий реагент TaqMan®, Perkin Elmer, Courtaboeuf, Франція) та ген мітохондріального MT-CYB (цитохром b або cyt b) кількісно визначали кількісною ПЛР у режимі реального часу. Ми ампліфікували частину цитохії гена мітохондрій специфічними праймерами (табл. 2). Суміші для ПЛР містили 7 мкл води, 12,5 мкл реагентів qPCR Mastermix Plus® (Eurogentec, Анже, Франція), 0,4 пмоль/мкл кожного праймера та 0,2 пмоль/мкл кожного зонда. Кожен зразок піддавали ПЛР у режимі реального часу в трьох примірниках. Умови посилення такі ж, як описано вище. Флуоресценцію вимірювали в кінці кожного етапу відпалу. Стандартна крива з 10, 100, 1000, 10 000 та 100 000 еквівалентів ядерного генома була включена в кожен цикл, а ті ж еквівалентні значення ядерного геному використовувались для кількісної оцінки генів β-актину та cyt b. Дані виражали як відношення середнього значення мітохондріальної ДНК (cyt b) триразових вимірювань до середнього значення ядерної ДНК (β-актину) триразових вимірювань для даного екстракту (mtDNA/β-актин).
імуногістохімія
Всього 34 фіксованих формаліном тканини печінки були отримані з наших наборів хірургічних патологій, які були ідентифіковані за допомогою комп'ютерної бази даних для проведення імуногістохімічних аналізів. Було 11 зразків печінки зі стеатозом, 11 зразків печінки без стеатозу, чотири інфіковані ВГС печінки, що виявляли стеатоз, і вісім зразків стеатогепатиту через надмірне споживання алкоголю (n = 4) або ожиріння (n = 4). Конструкцію мікрочипів тканин готували, як описано у Kononen et al. Кожен випадок містив триплет тканини печінки у вигляді плям діаметром 0,6 мм. Імуноофарбовування проводили із застосуванням стандартної методики авидин-біотинової пероксидази з колекцією антигену відповідно до досліджуваних антитіл. Основними антитілами, що використовувались, були моноклональні антитіла проти мітохондріального антигену (розведення 1:50, клон 113-1; Biogenex, Сан-Рамон, Каліфорнія, США), поліклональні антитіла проти TGFB1 (sc-82) (розведення 1: 100, Санта-Крус, CA)., CA, USA), анти-IL1-R1 (розведення 1: 400; AB-269-NA, R&D System, Лілль, Франція) та anti-IGF2 (1: 800 розведення; AF-292-NA, R&D System, Лілль, Франція). Діамінобензидин використовували як хромоген, а гематоксилін як ядерний контраст. Для негативного контролю первинне антитіло або опускали, або замінювали відповідною концентрацією нормального IgG того ж виду. Аналіз також був описовим та напівкількісним, враховуючи клітинне розташування сигналу на додаток до відсотка позитивних клітин з оцінкою 0 (відсутність фарбування), 1 (менше 25% клітин), 2 (між 25 і 75% клітин). ) і 3 (більше 75%). Інтенсивність імунофарбування також оцінювалась як 1 (слабка), 2 (середня) та 3 (сильна). Аналіз трьох ядер на зразок був подібним і показав однаковий ступінь фарбування між усіма ядрами для всіх антитіл, крім моноклональних антитіл проти мітохондріального антигену; визначався середній бал. Всі зрізи оцінювались незалежно двома патологами.
Статистичний аналіз
Середнє та стандартне відхилення розраховували в групі нежирної печінки та групі жирової печінки, а результати порівнювали з t-критерієм Стьюдента (a = 0,05). Результати імунохімії порівнювали з тестом χ 2 (α = 0,05).
результат
Експресія гена
Ми відібрали біопсію печінки на основі наявності або відсутності стеатозу печінки та відсутності мікроскопічних ознак запалення. Жоден із зразків не мав ознак фіброзу, тіл або цирозу. РНК отримували з 18 біопсій печінки людини (дев'ять і дев'ять без стеатозу печінки); ці дві групи не відрізнялись, за винятком того, що ІМТ був значно вищим у групі пацієнтів із стеатозом печінки.
РНК кожної біопсії печінки гібридизували до генних чіпів Affymetrix HG-U133A, що містять приблизно 22 300 людських розшифровок. Дендрограма, отримана шляхом агломерації ієрархічної кластеризації зразків печінки без відбору генів, показана на рисунку 1. Дев'ять стеатотичних зразків печінки кластеризовано, тоді як дев'ять нормальних зразків печінки мали більш неоднорідні профілі експресії генів.
Ієрархічна агрегація зразків нормальної та стеатотичної печінки. Ієрархічну кластеризацію агломерацій проводили без попереднього відбору генів, використовуючи евклідову відстань як міру різниці між зразками та середню асоціацію як міру відмінності між двома кластерами. "N" означає нормальну пробу печінки, а "S" означає стеатотичну пробу печінки.
Повнорозмірне зображення
Відповідно до знижувальних процедур контролю множини сімейств maxT (Wise Error Wise Error 5%, тобто 5% ймовірності мати принаймні одну помилку I типу), виявлено, що 110 послідовностей диференційовано виражаються у нормальних та стеатотичних зразках печінки . З них 100 послідовностей були надмірно експресованими, а 10 - недоекспресованими у стеатотичних зразках печінки. Списки надвиражених та недоекспресованих послідовностей наведені в таблиці 3. На малюнку 2 показані профілі експресії цих 110 послідовностей у 18 зразках печінки.
Стіл в натуральну величину
Профілі експресії 110 диференційовано експресованих послідовностей (FWER = 0,05) у дев'яти нормальних та дев'яти стеатотичних зразках печінки. Кожен рядок представляє послідовність зонду, а кожен стовпець - зразок печінки. Міри вираження стандартизовані для кожної послідовності зондів (тобто стандартизованих рядків). Палітра від зеленого до червоного використовується для вираження рівнів вираження, причому зелений відображає недовираження, а червоний - надмірне вираження. Назви генів наведені в таблиці 2. "N" означає нормальну пробу печінки, а "S" означає стеатотичну пробу печінки.
Повнорозмірне зображення
Гени класифікували у дев'яти сім'ях відповідно до їх функції (табл. 3). Одне з цих сімей включало гени, що кодують білки дихального ланцюга мітохондрій та ферменти, що беруть участь у метаболізмі ліпідів та синтезі креатину. Інше сімейство включало гени, що кодують іонні транспортери, ліпідні транспортери (аполіпопротеїн C-IV, який бере участь у виробництві ліпопротеїдів дуже низької щільності, тоді як аполіпопротеїн Е та рецептор В-типу, що поглинає тип 1, беруть участь у селективному поглинанні холестерину). Більшість диференційовано експресованих генів належали до сімейства факторів транскрипції (ядерні та мітохондріальні фактори транскрипції) або кодованих білків, що беруть участь у контролі клітинного циклу (передача сигналу, апоптоз та клітинний цикл), модифікації білка та ремоделювання позаклітинного матриксу. Дві групи генів були залучені або в шляхи відновлення пошкодження ДНК, або в шляхи запалення; це TOLLIP, єдина молекула IL-1R, пов'язана з Ig (SIGIRR) і TGFB1 .
Вміст мітохондрій та мітохондріальної ДНК у нормальній та жировій печінці
Кількісна ПЛР у реальному часі була використана для визначення співвідношення мтДНК до ДНК у 40 біопсіях печінки, включаючи 18 біопсій дослідження генного профілювання та 22 додаткових зразки. Середні співвідношення мтДНК до вмісту ДНК становили 0,67 ± 0, 10 та 1, 12 ± 0, 14 у групі біоптатів печінки без та зі стеатозом (Р = 0,011, таблиця 4). Цей результат підтверджувався імунофарбуванням мітохондрій за допомогою аналізу мікрочипів тканин (рис. 3). Дійсно, за допомогою глибокого фарбування та підрахунку кількості коричневих плям спостерігали збільшення кількості мітохондрій у гепатоцитах жирових крапель (макровезикулярний стеатоз) (рис. 3в та г). У нормальній печінці барвник поширюється на тканини печінки (рис. 3а та b). Напівкількісна оцінка фарбування показала значну різницю між двома групами (дві позитивні проби з 11 нормальної печінки проти дев'яти позитивних проб з 11 жирової печінки; χ 2; P
Приклади імунофарбування мітохондрій (коричневого кольору) специфічним антимітохондріальним антитілом у нормальній печінці ( a, b ) і в макровезикулярній стетоїдній печінці c, d ) з мікрочіпу тканини. Ядро фарбували гематоксиліном (синій). a ) Імунозабарвлення поширюється в нормальній тканині печінки (× 20), залишаючи ворітну вену. ( b ) (× 40) являє собою збільшення квадрата від точки ( a ) і показує пляму, розподілену в гепатоцитах. c ) Імунофарбування орієнтоване на стеатоз тканини печінки (× 20). ( d ) (x 40) являє собою збільшення квадрата від ( c ) і показує пляму, спрямовану навколо ядра та вакуолі з сильною інтенсивністю фарбування.
Повнорозмірне зображення
Перевірка експресії генів, пов'язаних зі стеарозом, в інших зразках печінки
Використовуючи процедуру TaqMan®, ми кількісно визначили три гени, що беруть участь у запальній реакції, які показали надзвичайно значущу диференційну експресію в нормальній та жировій печінці (табл. 2). Імовірно, ортологи проміжного проміжного сигналу миші знаходились в еволюційно збереженому шляху проходження мито (SITPEC), міф-взаємодіючому білку (TOLLIP) та мРНК SIGIRR. Ми підтвердили збільшення експресії мРНК цих генів у жировій печінці порівняно з нормальною печінкою (1, 71 ± 1, 03 проти 0, 90 ± 0, 19; 3, 28 ± 2, 24 проти 1, 41 ± 0, 54; 0, 74 ± 0,30 проти 0,48 ± 0,24 відповідно, таблиця 4). Ми проаналізували зв'язок між підвищеною експресією цих генів та ІМТ. Ми спостерігали лише тенденцію кореляції між рівнями мРНК TOLLIP та ІМТ (Р = 0,0555). Цікавим було збільшення експресії мітохондріального антигену, IL-1R1, IGF2 та TGFB1 при більшості стетозу та стеатогепатиту, пов’язаного з ВГС. IL1-R1 завжди сильно виражався у алкогольно-асоційованому стеатогепатиті або ожирінні та в половині стеатозу, пов'язаного з ВГС (табл. 5). На фіг.4 показано рівномірне поширення фарбування IL1-R1 у тканині печінки. На відміну від цього, IGF2 експресувався в нормальній печінці, і спостерігалося лише збільшення інтенсивності імуномаркування.
Стіл в натуральну величину
IL1-R1 експресується в цитоплазмі гепатоцитів у нормі ( a ) також у жирній печінці ( b ). Імунореактивність є більш інтенсивною у стеатотичних зразках. ( a, b ) × 20.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Наші результати також припускають, що позаклітинний матрикс може бути змінений на початкових етапах FLD. Це може бути пов’язано з підвищеною концентрацією внутрішньоклітинних жирних кислот у паренхімі печінки, які вже були виявлені безпосередньо токсичними для гепатоцитів, що призводить до окисного стресу, запалення та фіброгенезу, але не до токсичності для мітохондрій. Це також може бути пов’язано з надмірною експресією таких генів, як IGF2, IGFB4 та IGFBP, лабільна одиниця кислоти, або Claudin 3, або гепсин, що діють через активацію клітин/макрофагів або клітин Купфера TGFB1, що призводить до ремоделювання позаклітинного матриксу або активації клітин, як при регенерації печінки. або активація апоптозу в клітинах печінки для контролю маси гепатоцитів. Експресія 35, 36, 37, 38 білків TGFB1 та IGF2 була збільшена в більшості зразків, що демонструють або стеатоз, або стеатогепатит, і підтверджує наші результати профілювання експресії генів. Однак базальна експресія IGF2 у нестеатотичній печінці спричинила труднощі в інтерпретації результатів.
На закінчення, наші результати вказують на те, що мітохондрії відіграють важливу роль на ранніх стадіях стеатозу, можливо, для забезпечення катаболізму печінкових ліпідів, з посиленим фосфорилюванням і окислювальним метаболізмом мітохондрій. Хоча ніяких мікроскопічних ознак запалення на біопсіях печінки не спостерігалося, у жировій печінці не спостерігалося посилення експресії генів або білків, що беруть участь у запальних шляхах, та/або ремоделювання позаклітинного матриксу, таких як TGFB1, IL1-R1 та IGF2. Здається, IL1-R1 відіграє певну роль у розвитку як стеатозу, так і стеатогепатиту, і його можна вважати раннім і точним маркером у пацієнтів з ризиком розвитку НАСГ.
- Реальні історії про лікування дитячої епілепсії за допомогою медичної марихуани ЖУРНАЛ DAFSON
- Аналіз послідовності гена про-опіомеланокортину (pomc) у японців із діабетиком із ожирінням -
- Регенерація та підтримка належної функції печінки, жовчного міхура та підшлункової залози
- Поради пацієнтам із захворюваннями печінки
- Олія печінки тріски з Норвегії з натуральним фруктовим ароматом - Möller с