Дослідження іонної секреції епітеліальних клітин Докторська дисертація Деметра Університет Ірми Земмельвейс Докторська школа клінічної медицини Науковий керівник: д-р Габор Варга, професор, доктор Угорської академії наук Офіційні судді: д-р Беата Сперлаг, доктор Угорської академії наук д-р. Валата Кечкемети Члени екзаменаційної комісії: д-р Золтан Вінче, д-р Дьєрджі Симон, доктор Угорської академії наук, кандидат медицини д-р Петер Хегі, д-р Будапешт 2009

епітеліальними

ЗМІСТ ЗМІСТ ЗМІСТ. 2 СПИСОК СКОРОЧЕНЬ. 4 Слинні залози. 9 Секреція білка. 11 Механізм рідинної та іонної секреції. 12 Регулювання секреції. 15 Підшлункова залоза. 18 Механізм секреції білка. 19 Рідка та електролітна секреція. 19 Регуляція секреції. 24 ЦІЛІ. 27 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ. 28 Використовуються клітинні лінії. 28 Матеріали. 29 Зміст рішень. 29 Методи. 30 Підтримання культури клітин, підготовка до вимірювання. 30 Посадка. 30 Молекулярна біологія. 31 Вимірювання струму короткого замикання. 32 Мікрофлуорометрія. 32 Статистика. 34 РЕЗУЛЬТАТИ. 35 Дослідження секреції іонів клітинами Par-C10. 35 Рецидив внутрішньоклітинного ph від ацидозу. 37 Дослідження секреції HCO 3. 40 Дослідження наявності аніонітів. 42 Дослідження механізмів регуляції внутрішньоклітинних рівнів Ca 2+ клітин Par-C10. 44 2

Зміст Дослідження механізмів секреції іонів клітинної лінії HPAF із протоки підшлункової залози. 50 Вплив АТФ на секрецію. 50 Компенсація за ацидоз. 52 Вплив інгібіторів. 54 Трансепітеліальна секреція HCO 3. 58 ОБГОВОРЕННЯ. 60 Дослідження клітин, отриманих з привушної ацинусу щурів. 60 Дослідження секреції іонів клітинами Par-C10. Дослідження кліренсу Ca 2+ 60 на клітинах Par-C10, отриманих паротидами щурів. 63 Дослідження секреції іонів із клітинної лінії, що походить із протоки підшлункової залози. 66 ВИСНОВКИ. 69 РЕЗЮМЕ. 71 РЕЗЮМЕ. 72 БІБЛІОГРАФІЯ. 73 СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ. 84 ПОДЯКИ. 85 3

Абревіатури СПИСОК СКОРОЧЕНЬ ACh ацетилхолін ADP аденозин дифосфат AE аніоніт Ag срібло AgCl срібло хлорид AQP аквапорин, водний канал ATCC Американський тип Колекція клітинних культур ATP аденозин-5-трифосфат -ECECb-AM-2,7-BCECF-AM 2,7 5 - (а-6) -Карбоксифлуоресцеїн ацетоксиметиловий ефір НАЙКРАЩИЙ Іонний канал каналу бістрофіну Бромід-іон Br BZATP 3-O- (4-бензоїл) бензоїл-ATP CA вуглекислий ангідраза Ca 2+ іон кальцію [Ca 2+] i концентрація іонів кальцію в клітині CaCl 2 хлорид кальцію табір циклічний аденозилмонофосфат Capan-1 назва клітинної лінії CCh карбахол, карбамілхолін CCK холецистокінін cdns копія дезоксирибонуклеїнова кислота CFPAC-1 назва клітинної лінії CFTR цистозний фіброз трансмембранний регулятор провідності CFTR вх -172 CFTR gLC CLC хлорид-іон CLC хлорид-іон CLC хлорид-іон CLC Активований іонами кальцію хлорид-іонний канал CO 2 вуглекислий газ 4

Абревіатури CPA циклопіазонова кислота DAG діацилгліцерин DMEM/F12 Суміш модифікованого Дульбекко середовища Eagle та поживної суміші F12 HND DNDS 4,4-динітростилбензол-2,2-дисульфонова кислота E3KARP натрію гідрообмінник підтипу 3 кіназа A -тетрауксусна кислота EGFTA етітрацетна кислота EGFTA гліколь тетраацетат EIPA 5- (N-етил-N-ізопропіл) амілорид ENaC епітеліальний іонний натрієвий канал ER ендоплазматичний ретикулум EtBr етидій бромід FBS фетальна теляча сироватка FGF фактор росту фібробластів GRGF фактор росту фібробластів 4-диізотіоціанатодигідростилбелбен-2-гідростильбен-2-кислота Рецептор гістамінового рецептора підтип 2 hbest білок бістрофіну людини HCO 3 бікарбонат-іон HEPES 4- (2-гідроксиетил) -1-піперазинтансульфонова кислота HOE-694 3-метилсульфоніл-4-піперидинобензоїл гуанідин HPAF назва клітинної лінії, виділеної з панкреатичної залози I аденокарциноми K іонний канал калію IP 3 инозитол трифосфат IRBIT - разом з IP 3 виділений IP 3-рецептор, що зв’язує білок I SC струм короткого замикання K + іон калію KCl хлорид калію KCC хлорид калію сімейство транспортерів 5

Абревіатури KCNK K підсімейство калієвих каналів KCNMA високопровідна активована іонами кальцію іон калію канал M підсімейство KCNN середньопровідна активована іонами кальцію іон калію канал N підсімейство Kschanthane іонно-високий транспортер KbN, виділений з бічної нирки нирок типу бікарбонат натрію провідний Ca 2 + -активоване сімейство K + каналів MEM Мінімальне необхідне середовище Mg 2+ іон магнію Mg-ATP магній аденозин трифосфат MgCl хлорид магнію MRNS месенджер, месенджер РНК MSD область проникнення мембрани Na ​​+ іон натрію NaH натрій натрій -бікарбонат NANC неадренергічний нехолінергічний NBCn бікарбонат натрію котранспортер NBCn1 електронутральний бікарбонат натрію котранспортер підтип 1 NBD нуклеотид зв'язуючий регіон NCX натрій кальцій обмін NEAA незамінні амінокислоти NGF нейрогенний фактор росту NH 4 + - ammni Cl Хлорид амонію NHE Натрій Гідрообмін NHERF Натрій Гідроген Обмін Стандарт регуляторний фактор NK нейрокінін NKCC натрій калій-2 хлорид котранспортер NMDG + N-метил-D-глюкамін іон 6

Абревіатури NO оксид азоту NO 3 нітрат-іон NSF N-етилалеймід-чутливий фактор O 2 кисень PACAP гіпофіз аденілілциклаза, що активує пептид Par-C10 є паротидною ацинарною клітинною лінією щура PAT передбачуваний аніонний транспортер PBS фосфатний буфер ПЛР полімеразна ланцюгова реакція PDZ гліцин-гліцин -фенілаланін амінокислотна послідовність ph i внутрішньоклітинна ph PKA протеїнкіназа PKC протеїнкіназа-c PLCβ фосфоліпаза Cβ Іон кальцію АТФаза в плазматичній мембрані PMCA pnbc підшлункова залоза ідентифікована в підшлунковій залозі бікарбонат натрію котранспортер тирозин пептид P-дріжджі поліпептид сімейство пуринергічний рецептор пуринергічний рецептор назва родини рецепторів Область регулювання домену РНК РНК рибонуклеїнова кислота RT-PCR зворотна транскриптаза полімеразна ланцюгова реакція RyR ріанодіновий рецептор SEM стандартна похибка середнього значення, середнє відхилення SK середньопровідна активована іонами кальцію іон калію канал SLC розчинена речовина транспортер високопровідна активована іонами кальцію іонний канал калію SNAP NSF-зв'язуючий білок SNARE SNAP-рецептор STE ATP-зв'язуючий транспортер, виражений у дріжджах 7

Абревіатури ЗАВДАННЯ TWIK (двопоровий слабкий внутрішній K + канал), пов'язаний з кислоточутливим K + каналом TER трансепітеліальний опір t-пастка асоційована ціль SNARE UTP уридин трифосфат VAMP міхурово-асоційований мембранний білок VIP вазоактивний кишковий білок V m різниця потенціалів v-малий пасток асоційований з пухирцями SNARE 2MeSADP 2-метилтіо-АДФ 5-НТ 5-гідрокситриптамін, серотонін 8

Вступ На вершині піраміди знаходиться безліч зрілих або зрілих секреторних гранул, з яких екзоцитозом виділяється вміст білка, що зберігається. Рисунок 1: Розташування слинних залоз у людини. (джерело: http://3.bp.blogspot.com) Рисунок 2: Клітинна структура слинної залози. (джерело: http://www.nanomedicine.com) 10

Вступ - це найвідоміший член сім'ї на молекулярному рівні (9, 11, 12). Імуногістохімія також виявила котранспортер хлориду калію 1 (KCC1) сімейства SLC12A у базолатеральній мембрані ацинарних клітин слинних залоз, але його роль досі не відома (9). Поглинання Cl забезпечується взаємодією обмінника Na +/H + (NHE) та обмінника HCO 3/Cl у базолатеральній мембрані. З вивільненням H + і HCO 3 поглинаються Na + і Cl (8, 9). Цілком імовірно, що ізоформа NHE1, яка знаходиться у всіх клітинах і відіграє важливу роль у підтримці клітинного рН, виконує цю функцію (9). Крім того, у ацинусі слинних залоз виявлені форми NHE2, NHE3 та NHE4, з яких NHE2 та NHE3 експресуються в апікальній мембрані, а функція NHE4 ще не відома (9). Серед аніонітів обмінники AE2 та AE4, що належать до сімейства SLC4, були виявлені на базолатеральній стороні людських та щурячих привушних ацинів (9, 10). AE2 експресується майже у всіх типах тканин (13), тоді як AE4, швидше за все, з'являється лише в базолатеральній мембрані проток слинних залоз (14), тому він не відіграє ролі в секреції аніонів. Малюнок 3: Система транспортування ацинусом слинної залози. 13

Вступ Обмінники Cl/HCO 3 та Na +/H + (ймовірно, NHE3) (9) також знаходяться в апікальній мембрані клітин протоки (31). На базолатеральній стороні виявлено експресію хлоридного каналу та Na +/H + -обмінника (NHE2) (9) (31) (31) (рис. 4). У клітинах протоки відсутні водні канали, тому вони не вбирають воду, слина стає гіпосмотичною та лужною. Зі збільшенням вироблення слини іонний склад слини стає дедалі більше схожим на плазмовий. Це явище пов’язане з тим, що протоки менш здатні змінювати склад первинної слини, яка швидко проходить через протоки, ніж у стані спокою. Рисунок 4: Модельна схема системи транспортування іонів протоки слинної залози. Регуляція секреції Слюновиділення регулюється виключно вегетативною нервовою системою, інтенсивність якої визначається секрецією ацинарних клітин. Оскільки протоки поглинають іони з первинної слини, а не виділяють їх і не можуть транспортувати воду, вони не можуть змінити кількість слини. У базолатеральній мембрані ацинарних клітин 15

Вступ Секреція проток стимулюється також АТФ та аденозином на апікальних рецепторах при секреції ацинів (65). На їх поверхні було виявлено ряд рецепторів P2, включаючи рецептори P2Y 2, P2Y 4, P2X 4 та P2X 7. Інтерстиціальний АТФ з нервових закінчень, острівцевих клітин, базолатеральних транспортерів або витоку ацинів, ймовірно, через рецептор P2Y 2 або P2Y 4, пригнічує функцію базолатерального каналу K +, а через це і секрецію аніонів (33). На апікальній стороні рецептори Р2Х, швидше за все, експресуються. Їх стимуляція не може ініціювати секреторні процеси, але посилює секреційну секрецію іонів (33). Накопичення та секреція АТФ ацинами з гранул та мембранно-специфічна експресія рецепторів, що спостерігаються в протоках, свідчать про те, що АТФ може бути інформатором інформаційного потоку між ацинами та протоками (33). 26

Цілі Завдання У наших дослідженнях ми прагнули відповісти на наступні питання: 1. Чи є трансепітеліальна секреція HCO 3 у привушній ацинарній клітинній лінії Par-C10 і, якщо так, то які механізми їй допомагають. 2. Які механізми регулюють внутрішньоклітинний рівень Са 2+ у клітинах Par-C10. 3. Чи відбувається трансепітеліальний транспорт HCO 3 і за допомогою якого способу відбувається в клітинній лінії, що походить від аденокарциноми підшлункової залози людини, яка не містить функціональної CFTR. 27

Матеріали та методи Методи Підтримання та підготовка культури клітин до вимірювання Клітинні лінії культивували у всіх випадках у зволоженому повітрі 37 ° C, збагаченому 5% CO 2, у шафі для культури. Клітини HPAF були отримані з ATCC. Їх доповнювали MEM, що містить L-глутамін і NEAA, Na-піруват, 10% FBS, 100 МО/мл пеніциліну та 1 мкг/мл стрептоміцину. Клітини проходили 1:10 на тиждень. Привушні клітини щурів Par-C10 Par-C10 були щедрими пожертвами від доктора Девіда Квісселя (Школа стоматології, Центр наук про охорону здоров’я Університету Колорадо, Денвер). Клітини культивували в середовищі DMEM/F-12 1: 1 з додаванням 10% плодової телячої сироватки, 0,1 мкМ ретиноевої кислоти, 2 нм трийодтироніну, 0,4 мкг/мл гідрокортизону та 100 МО/мл пеніциліну, додавали 1 мкг/мл стрептоміцину . Клітини проходили 1:50 на тиждень. Трансплантаційні клітини висівали на поверхню поліефірної мембрани (Costar, Transwell-CLEAR) з кількістю клітин 500k. Їх інкубували в середовищі в стерильних умовах. Засіб змінювали кожні 2 дні. Утворення конфлюентного моношару контролювали шляхом регулярного вимірювання трансмембранного опору (TER). Експерименти проводили через 10-12 днів, коли резистентність досягала 1000/см 2 для клітин HPAF та 3000/см 2 для клітин Par-C10. 30