аутоімунного

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Скринінг білків та огляд встановлених аутоантигенів
  • Ціле дослідження білків визначає PDILT та MAGEB2 як нові імунні мішені
  • Перевірка MAGEB2 та PDILT як основних аутоантигенів гонад
  • обговорення
  • методи
  • Зразки пацієнтів
  • Скринінг білкового поля
  • Статистичний аналіз
  • Аналізи зв'язування радіоактивних лігандів PDILT та MAGEB2
  • Аналіз експресії ПЛР цифровою краплею
  • імуногістохімія
  • Аналіз збагачення генної онтології
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додатковий набір даних
  • Коментарі

предметів

реферат

Аутоімунний поліендокринний синдром 1 типу (APS1) - це моногенний розлад, що характеризується множинними проявами аутоімунного захворювання. Це пов’язано з мутаціями гена аутоімунного регулятора (AIRE), які сприяють експресії тимусу тисяч антигенів периферичної тканини в процесі, критичному для визначення центральної імунної толерантності. Тут ми використовували протеомічні поля для проведення всебічного дослідження аутоімунних мішеней у APS1. Допит введених аутоантигенів виявив високонадійне виявлення аутоантитіл, і, дослідивши групу з понад 9000 білків, ми далі визначили MAGEB2 та PDILT як нові основні аутоантигени в APS1. Наша оцінка цілого протеома виявила значне збагачення тканин-специфічних імунних мішеней, що відображає селективність AIRE для цієї категорії генів. Наші висновки також свідчать про те, що імунна система в APS1 націлена лише на дуже обмежену частину протеома, на відміну від широкого дефекту прояву тимусу, пов’язаного з дефіцитом AIRE, і ставить нові питання щодо того, які інші фактори необхідні для порушення толерантності.

результат

Скринінг білків та огляд встановлених аутоантигенів

Повнорозмірне зображення

У пацієнтів з APS1 розвиваються складні комбінації аутоімунних проявів. Ми оцінили кореляцію між встановленими аутоантитілами, щоб краще зрозуміти, як окремі аутоімунні реакції були взаємопов'язані. Вказано аутоантитіла до двох тісно пов'язаних інтерферонів типу 1; IFNW1 та IFNA1 показали сильну кореляцію (ρ Спірмена ρ = 0,79). Подібним чином ми спостерігали кореляцію між аутоантитілами до GAD2 та GAD1 (ρ = 0,70), які є декарбоксилазами глутамінової кислоти та ко-експресуються в клітинах острівців підшлункової залози та нейронах, що продукують гамма-аміномасляну кислоту (GABA). Цікаво, що ми також виявили кореляцію між TPH1 і DCC (ρ = 0,70), які належать до різних сімейств ферментів, але обидва вони беруть участь у синтезі моноамінів і ко-експресуються в клітинах, що продукують серотонін, у центральній нервовій системі та кишечнику (Рис. 1в).,

Ціле дослідження білків визначає PDILT та MAGEB2 як нові імунні мішені

Ми оцінили повну групу з понад 9000 людських білків, щоб визначити основні імунні мішені у пацієнтів з APS1. В якості першої фільтрації ми виключили всі мішені, які не досягли інтенсивності сигналу вище 5000 в жодній з досліджуваних сироватк або більше 2000 в негативній пробі (поле зондується лише з реагентом для виявлення та без сироватки). Щоб відібрати специфічні для пацієнта сигнали, ми тоді порівняли частоту позитивних осіб між пацієнтами з APS1 та здоровою контрольною групою, використовуючи точний тест Фішера (поріг = середній здоровий + 3SD). Серед найбільш значущих сигналів було виявлено та виключено низку артефактів забруднення під час друку. Тоді наш анотований набір основних імунних цілей при скринінгу на протеомічне поле включав одинадцять інтерферонів типу 1, ще шість відомих аутоантигенів (IL22, TPH1, DDC, GAD1, GAD2 та GIF), трансглутаміназу 4 (TGM4) 32 та три нові аутоантигени-кандидати - яєчка експресується білковою дисульфідізомеразою (PDILT), сімейством меланом В2 (MAGEB2) та антигенами MAGEB4. Сигнали автоантитіл групуються відповідно до їх корелятів Спірмена, використовуючи повне ієрархічне групування зв’язків. Відстань = 1 - кореляція.

Повнорозмірне зображення

MAGEB2 та PDILT були визначені головними імунними мішенями при скринінгу протеомних полів. Аутоантитіла до MAGEB2 були виявлені у 21 з 51 (41%) пацієнтів з аутоантитілами до APS1 та PDILT у 19 з 51 (37%) пацієнтів з APS1, тоді як вони відсутні у контрольних групах (поріг = середній здоровий + 3 СД) ( a ). Аналізи зв’язування радіолігандів, чоловіки з ідіопатичним безпліддям (n = 114), використовувались для перевірки аутоантитіл до MAGEB2 та PDILT у виявленій когорті, у когорті реплікації 42 пацієнтів з APS1 та в контрольних когортах, які включали жінок з передчасною недостатністю яєчників (n = 114). = 76) та здорових осіб (n = 91) ( b ). Загалом аутоантитіла до MAGEB2 були виявлені у 31 із 92 (34%) пацієнтів з APS1, у чоловіків з ідіопатичним безпліддям та у жінок з передчасною недостатністю яєчників, і вони відсутні у всіх здорових контрольних груп. Аутоантитіла до PDILT були виявлені у 28 з 93 (30%) пацієнтів з APS1 і були відсутні у всіх здорових та всіх контрольних захворювань (граничне значення = значення 15.

Повнорозмірне зображення

Перевірка MAGEB2 та PDILT як основних аутоантигенів гонад

Ми перевірили розподіл мРНК MAGEB2 та PDILT в тканинах на панелі з одинадцяти тканин людини за допомогою цифрової краплинної ПЛР. Розшифровки MAGEB2 та PDILT були виявлені у високих рівнях у тканині яєчка та відсутні в тканинах негонад (Малюнок 4а та Додатковий Рисунок S12). Для визначення клітинного розподілу MAGEB2 та PDILT у яєчках ми провели імунофарбування на тканині яєчка людини. Мічені сироваткою статеві клітини MAGEB2 на всіх стадіях диференціювання. Антисироватка PDILT фарбувалася переважно для підмножини статевих клітин, розташованих поблизу просвіту насінної труби, що відповідає клітинам пізньої фази диференціації сперматогенезу, згідно з попередніми звітами 34 (рис. 4b). Взяті разом, наші результати показують, що MAGEB2 та PDILT є основними аутоантигенами статевих залоз у APS1.

Розподіл мРНК MAGEB2 та PDILT досліджували в одинадцяти зразках тканин людини методом цифрової краплинної ПЛР. Розшифровки MAGEB2 та PDILT були специфічно виявлені в тканині яєчка ( a ). Щоб дослідити розподіл клітин MAGEB2 та PDILT в яєчках, ми провели імуногістохімію на насінній тканині людини ( b ). Статеві клітини фарбують MAGEB2-антисироваткою на всіх стадіях диференціювання. Також спостерігалася неспецифічна ядерна позитивність. PDILT-антисироватка фарбувалась переважно на підмножині статевих клітин, розташованих поблизу просвіту насінної труби. Негативний контроль включається, якщо первинне антитіло було забарвлене.

Повнорозмірне зображення

обговорення

APS1 має множинні аутоімунні імунні функції та реакції аутоантитіл на різні тканини. Хоча в окремих дослідженнях було визначено кілька імунних цілей, аутоімунна експресія APS1 ще не була всебічно зафіксована. У цьому дослідженні ми оцінили відповідь В-клітин проти пулу з понад 9000 людських білків, щоб забезпечити детальне профілювання відомих аутоантигенів та виявити нові імунні мішені в APS1. Огляд кількох встановлених аутоантигенів виявив надзвичайно надійне виявлення аутоантитіл, і, дослідивши все поле, ми далі визначили два нових аутоантигени, MAGEB2 та PDILT, які можна було підтвердити незалежними методами та в когорті реплікації.

Дослідження на APS1 та його тваринній моделі пролили світло на процес, за допомогою якого імунна система навчається самозвіту 12. Однак залишається неповним зрозуміти, як центральний дефект толерантності при дефіциті AIRE перетворюється на аутоімунні відповіді, оскільки раніше не проводились комплексних досліджень аутоімунних мішеней у пацієнтів з мишами з дефіцитом APS1 або Aire. Наша широка характеристика мішеней В-клітин пропонує нові засоби оцінки цих подій.

Потрібно розглянути кілька пояснень щодо того, чому аутоімунна реакція виявляється на порядок більш обмеженою, ніж можна було б очікувати від дефекту в залежності від AIRE-антигену. По-перше, слід визнати, що розпізнавання антигенів залежить від MHC, і лише частина підгруп самоантигенів, як очікується, матиме необхідні вимоги до ефективного представлення до MHC та викликати сильні імунні реакції. Слід також враховувати потенційні ефекти толерантності до В-клітин та периферичних механізмів толерантності, які можуть забезпечити додаткові фільтри для розвитку аутоімунних реакцій. Нещодавні дослідження у пацієнтів з APS1 також з'ясували роль периферичної презентації антигену в аутоімунних проявах 32. Встановлено, що аутоантитіла до специфічного для простати ферменту розвиваються лише у чоловіків, і лише після досягнення віку дозрівання простати в пубертатному віці для розвитку аутоімунної відповіді було необхідним зазначення експресії периферичного антигену. Цей рідкісний приклад статевого диморфного аутоантигену припускає, що залежні від AIRE гени повинні експресуватися на периферії на достатньому рівні, щоб викликати реакції аутоантитіл.

Ми також дослідили, чи розділяють аутопротигени APS1 частини функціональних характеристик як тканинних, і шукали надмірно представлені терміни генної онтології серед основних імунних цілей на екрані. Найчастіше вживаний онтологічний термін стосується метаболізму амінокислот та похідних та сигналізації клітинних клітин. Терміни біосинтез нейромедіаторів та зв'язування вітамінів були збагачені серед імунних мішеней (див. Додаткову таблицю S3).

Ми визначаємо MAGEB2 та PDILT як нові основні аутоантигени у APS1. Цікаво, що як MAGEB2, так і PDILT специфічно експресуються в статевих клітинах гонад. MAGEB2 є членом сімейства генів, згрупованих у дозозалежній області чутливого статевого обороту Х-хромосоми і експресується в тканині яєчка, а також у різних пухлинах35. PDILT - це специфічний для яєчок білок, який демонструє гомологію до дисульфідних ізомераз 33, 34, 41. PDILT функціонує в комплексі специфічних для статевих клітин шаперонів, що має важливе значення для фертильності чоловіків 41. Зокрема, незважаючи на очевидну специфічну експресію яєчок, аутоантитіла до MAGEB2 та PDILT були присутні як у чоловіків, так і у жінок з APS1. Це спостереження, разом із досвідом використання аутоантигену передміхурової залози в APS1 32, порушує питання, чи можуть MAGEB2 та PDILT також експресуватись в жіночих тканинах. Гени MAGEB дійсно експресуються в жіночих статевих клітинах і, схоже, відіграють важливу роль у жіночому гаметогенезі 36. Вважається, що багато генів з явною специфічною експресією яєчок також експресуються в жіночих статевих клітинах, і що експресія ооцитів легко не помічається при аналізі грубої тканини яєчників. .

Експресія MAGEB2 та PDILT для гонад викликає питання про те, чи можуть ці антигени відігравати роль у безплідді APS1. Безпліддя характерно як для чоловіків, так і для жінок із APS1 8. Жіноче безпліддя в більшості випадків пояснюється передчасною недостатністю яєчників та аутоімунітетом проти клітин, що продукують стероїди яєчників. Нещодавно аутоімунітет передміхурової залози було визначено як основний прояв APS1 з потенційною роллю у розвитку чоловічого безпліддя 32. Ідентифікація MAGEB2 та PDILT виявляє статеві клітини статевих залоз як основні імунні мішені у APS1 та описує ще один аутоімунний компонент, який потенційно може сприяти безпліддям у чоловіків та жінок із APS1.

методи

Зразки пацієнтів

Усі пацієнти дали інформовану згоду на участь.

Скринінг білкового поля

Зондування та сканування білкового поля (ProtoArray® v5.0 PAH0525020, Life Technology) проводили згідно протоколу Invitrogen для профілювання імунної відповіді BioMarker з використанням рекомендованого реагенту для виявлення (Alexa Fluor® 647 Goat anti-human IgG A21445, Invitrogen) та блокуючого буфера. (блокуючий буфер). буферний набір PA055, Invitrogen). Поля аналізували із сироваткою у розведенні 1: 2000. Поля сканували за допомогою сканера мікрочипів GenePix 4000B, а для вирівнювання та збору даних використовували програмне забезпечення мікрочипів GenePix® Pro (v6.1).

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз даних протеомічного поля проводили при log-трансформованій інтенсивності. Точний тест Фішера був використаний для класифікації цільових білкових полів, які відрізнялися між пацієнтом APS1 та здоровою контрольною групою. Сигнал вважався позитивним, якщо значення інтенсивності було вище середнього здорового + 3SD.

Аналізи зв'язування радіоактивних лігандів PDILT та MAGEB2

Аутоантитіла до PDILT та MAGEB2 вимірювали за допомогою аналізів зв'язування з радіолігандами. Клони людських кДНК для PDILT (SC306958, Origene, номер приєднання NM_174924) та MAGEB2 (SC122625, Origene, номер приєднання NM_002364) клонували у вектор експресії pTNT (L5610, Promega) та транскрибували та транслірували in vitro у присутності 35 S метіоніну TNT Systems). Імунопреципітацію проводили на 96-лункових фільтраційних планшетах (Millipore). Позитивний стандарт, сироватка пацієнта APS1 з відомою реакційною здатністю та негативний стандарт, 4% BSA, були включені в кожну пластину. У кожну лунку додавали 30 000 CPM радіоміченого білка та 2,5 мкл зразка сироватки. Всі сироватки аналізували двічі. Сироваткові антитіла іммобілізовували до білка А Сефарози (nProtein A Sepharose TM 4 Fast Flow, GE Health Care) під час інкубації протягом ночі. Радіоактивність вимірювали в мікро-бета-лічильнику (1450 Microbeta Trilux, Wallac). Значення індексу аутоантитіл розраховували відповідно до наступного: (значення вибірки/від’ємне стандартне значення)/(позитивне стандартне значення/від’ємне стандартне значення) × 100.

Аналіз експресії ПЛР цифровою краплею

Загальна РНК від Origene була перетворена в кДНК за допомогою дволанцюгового набору синтетичних кДНК Life Technologies та протоколу із випадковими гексамерами (N8080127, Life Technologies) для першого ланцюгового синтезу. Використовували супермікс ddPCR від Bio-Rad для зондів (186-3040, BioRad), і генерацію крапель проводили за стандартним протоколом BioRad із зондами TagMan для PDILT та MAGEB2 та β2M як контролю (1206926, 4351372 та 4448489, Life Technologies). Зразки запускали на машині Quantalife ddPCR, а програмне забезпечення Quantasoft використовувалося для збору та аналізу даних.

імуногістохімія

Фарбування для MAGEB2 та PDILT проводили на тканині яєчка людини, закріпленій у формаліні, зафіксованій парафіном, за допомогою автостайнера 480 (Thermo Fisher Scientific). Слайди тканин спочатку інкубували з блоком Ultra V (TA-125-UB, Thermo Fisher Scientific, Inc.) протягом 5 хвилин, а потім інкубували або з анти-MAGEB2 (49-718, ProSci) при розведенні 1: 1750 або проти PDILT (HPA041923, Sigma) при розведенні 1: 1000 протягом 30 хвилин. Потім предметні стекла інкубували з міченою пероксидазою-полімером хрону протягом 30 хвилин, а потім розчином 3, 3′-діамінобензидину (DAB) протягом 2 × 5 хвилин. Скла були забарвлені в гематоксиліні Mayers (01820, Histolab) протягом 5 хвилин, використовуючи Autostainer XL (Leica), а потім промивали у воді карбонату літію (розведеному 1: 5 із насиченого розчину) протягом 1 хвилини. Слайди зневоднювали в сортовому етанолі і, нарешті, покривали (PERTEX, Histolab) за допомогою автоматизованого скляного чохла (CV5030, Leica). Слайди сканували за допомогою автоматизованої системи сканування Aperio XT (Aperio Technologies).

Аналіз збагачення генної онтології

Для пошуку статистично надмірно представлених термінів генної онтології (база даних GOa-людина), присвоєних встановленим аутоантигенам, присутнім у масиві, ми використовували онлайн-програмне забезпечення GOstat 45. Щоб уникнути того, щоб інтерферони повністю виграли інші гени в аналізі збагачення GO, інтерферони були представлені лише IFNA13 та IFNW1.

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Landegren, N. et al. Загальнопротеомне обстеження аутоімунного цільового репертуару при аутоімунному поліендокринному синдромі типу 1. Sci. Респ. 6, 20104; doi: 10.1038/srep20104 (2016).

Додаткова інформація

Файли PDF

Додатковий набір даних

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.