Очищення надмірно експресованого білка утворює другий, і не менш важливий, етап виробництва чистого рекомбінантного білка в гетерологічній експресійній системі. Рідко ми отримуємо рекомбінантний білок безпосередньо з рідкого позаклітинного середовища (культурального середовища), хоча деякі експресійні системи дозволяють таку секрецію білка. Першим кроком очищення будь-якої молекули від біологічного матеріалу є порушення клітинної стінки та цитоплазматичної мембрани, тим самим вивільнення її в розчин.
Ми знаємо кілька способів руйнування клітин:
- повторюється заморожування та розморожування матеріал - порушення спричинене утворенням кристалів льоду (може денатурувати деякі білки)
- механічні - гомогенізація в ступці або більш складному апараті
- хімічна - різні сильні миючі засоби, розчинники (вони можуть денатурувати деякі білки; їх потрібно використовувати для солюбілізації мембранних білків - наприклад, Triton X-100, CHAPS)
- ферментативні - дія ферментів на клітинні стінки (наприклад, целюлази, пектинази, лізоцим для бактерій, зимолаза для дріжджів)
У випадку з білками "агресивний" метод (або їх поєднання) залежить від їх розташування (наприклад, ядра клітини, цитоплазми, мембранного білка, периплазматичної локалізації у випадку грамнегативних бактерій), а також від походження та характеру клітин (наявність клітинної стінки).) повинен використовуватися для:
- виділив достатню кількість білка в розчин, тобто розчинна фаза
- зберігають форму (конформацію) та біологічну активність білка
Зв’язок гомогенізації
Гомогенізація - один із механічних методів руйнування клітин. Після гомогенізації білки вводяться в розчин, який повинен мати певний відповідний склад і рН, щоб не втратити своїх біологічних властивостей. Ми його кличемо буфер (буфер), тому що він "зменшує" коливання рН, які викликані різними хімічними сполуками.
| буфер | діапазон рН |
| фосфат (NaH2PO4 + Na2HPO4) | 5,8 - 8,0 |
| Трис-HCl | 7,0 - 9,0 |
| цитрат (ацетат натрію + лимонна кислота) | 3,0 - 6,2 |
Найбільш використовуваними гомогенізаторами є:
- Гомогенізатор Поттера - найпоширенішим матеріалом є культури клітин тваринного походження, які гомогенізуються натиранням поршня об скляний розчин у формі циліндра
- ультразвуковий гомогенізатор, т. зв. сонікатор - використовує ультразвукові хвилі для руйнування клітин
- Французька преса - високий тиск (6000-10000 фунтів/кв. дюйм) застосовується до суспензії комірок за допомогою гідравлічного насоса, після чого суспензія раптово виводиться через вузький капіляр, клітини лопаються через декомпресію та зсувну силу, що залишає камеру; Французька преса в основному використовується для вилучення білків з бактеріальних клітин
- гомогенізатори, що використовують магнітну силу, перетворену в кінетичну енергію гранул для руйнування клітин, яка порушує поверхню клітин тертям і перемішуванням суспензії; їх часто використовують для вилучення білків з органів і тканин тварин
Результатом гомогенізації є суспензія - гомогенат.
Буферні добавки посилання
Використання різних хімічних речовин як добавок в буферному розчині не завжди необхідно. Це речовини, які допомагають солюбілізувати або стабілізувати певні білки. Відповідно підібрані добавки не повинні впливати на інші процедури очищення, або слід знімати з розчину шляхом діалізу або гель-фільтрації.
| групи | приклад | остаточна концентрація | мета використання |
| сіль | NaCl, KCl, (NH 4) 2 SO 4 | 50-150 мМ | підтримка іонної сили розчину, взаємодія білків з носієм, осадження білків |
| миючі засоби | Triton X-100, NP-40, CHAPS | 0,1-1% | солюбілізація мембранних білків |
| гліцерин | - | 5-10% | стабілізація та запобігання агрегації білка |
| вуглеводи | глюкоза, сахароза | 25 мМ | стабілізація мембран лізосом є запобіганням секреції протеази |
| хелатори двовалентного катіону ("поглиначі") | EDTA, EGTA | 1 мМ | зменшення окисного ушкодження, інгібування деяких протеаз |
| відновники | DTT | 1-10 мМ | зменшення окисного ушкодження, при більш високій концентрації зменшення S-S зв’язків |
| β-меркаптоетанол | 0,05% | ||
| ліганди, іони металів | Mg 2+, ATP, GTP | 1-10 мМ | стабілізація деяких білків |
Посилання для ультрацентрифугування
Гомогенат містить різні великі і важкі частинки (клітинний сміття, тобто уламки клітин, органели, мембрани) та розчинний матеріал (рис., А1, В2). Використовуючи кілька циклів центрифугування з різною швидкістю та часом, ми можемо певною мірою відокремити певні фракції бажаними білками (рис., А). Центрифугування на дуже низьких швидкостях (500 г/10 хв) дозволяє виділити найважчі ядра клітини (рис., А2), щоб воно було придатним для екстракції ядерних білків. Припускаючи, що наш рекомбінантний білок розчинний, ми центрифугуємо на більш високих швидкостях (10 000 г/20 хв), щоб видалити більшу частину непотрібного, забруднюючого матеріалу. Навпаки, ізоляція мембранних частинок мембранними білками вимагає ультрацентрифугування (100 000 г/60 хв) (рис., А3). Центрифугування ділить суспензію на нерозчинні осад (гранули) (внизу трубки) і супернатант (рішення).
Однак іноді це може бути корисно градієнт щільності диференціальне центрифугування (наприклад, сахароза) (рис. B1), особливо якщо ми хочемо відокремити клітинні органели або легші тіла включення, утворені рекомбінантними білковими агрегатами, від клітинного сміття. У цьому випадку найважче сміття осідає на дні трубки, але легші частинки не можуть опускатися нижче рівня більш концентрованого розчину сахарози. В результаті отримують гранулу, розділену на окремі фракції (рис., В3), відповідно до щільності сахарози. Розчинний матеріал завжди буде у самій верхній фракції, оскільки він є найлегшим.
Посилання на білкові опади
Крім того, білки часто потрібно вибірково осаджувати - осад з неоднорідного розчину. Найбільш вживаною хімічною речовиною є сульфат амонію - (NH4) 2SO4, що викликає т. Зв поступовий засолювальний ефект білки залежно від їх розчинності у розчині з різною іонною силою. В основі принципу лежить "конкуренція" сульфату амонію з білком за молекули розчинника (води). Обложений білок утворює агрегати (за допомогою гідрофобних взаємодій), так що він відокремлюється від розчинної фази центрифугування. Таким чином, при збільшенні концентрації сульфату амонію можна збирати кілька фракцій, що містять різні білки, та аналізувати ці фракції на наявність відповідного рекомбінантного білка (наприклад, за допомогою SDS-PAGE).
Опадання білків таким чином не викликає денатурації білків. Сульфат амонію можна вивести з розчину діалізом. Це швидкий і недорогий метод початкового видалення більшості забруднюючих білків.
Діалізне посилання
Діаліз білкового розчину - це метод видалення з розчину низькомолекулярних хімічних речовин, які можуть негативно вплинути на подальші етапи очищення, або біологічні властивості білка. Діаліз проводиться в діалізних мішках при постійному перемішуванні в буфері та при низькій температурі (4 ° С). Пори мішка для діалізу дозволяють проходити лише невеликим молекулам, поки не буде досягнуто рівноваги між композиціями двох розчинів. Білок залишається закритим всередині мішка для діалізу.
За допомогою діалізу деякі білки можуть бути ренатуровані до біологічно активної конформації. Для того щоб ренатурація була максимально ефективною, вона повинна проходити дуже повільно, часто у дуже розведеному розчині, а отже, у великому обсязі.