- предметів
- реферат
- вступ
- результат
- Експресія EcSOD відсутня у культивованому 2D HMEC
- Вираз Ген EcSOD реактивується в HMEC, культивованому в 3D
- 3D-культивований HMEC демонструє нижчий рівень окиснення DCFH порівняно з клітинами в моношаровій культурі
- Тиша Ген EcSOD у культивованому 2D HMEC пов'язаний з гіперметилюванням промоторної ДНК
- Експресія EcSOD значно знижується в клінічних тканинах раку молочної залози, а рівні її експресії мРНК корелюють протилежно клінічній стадії
- Повторна експресія EcSOD пригнічувала утворення зірчастих колоній клітин раку молочної залози в 3D культурі
- Надмірна експресія EcSOD пригнічує експериментальні метастази в легенях клітин MDA-MB231 та тривале виживання тварин
- EcSOD знизив швидкість спонтанного метастазування клітин аденокарциноми молочної залози миші на сингенній моделі миші
- обговорення
- Додаткова інформація
- Файли зображень
- Додаткова фігура 1
предметів
- Рак молочної залози
- Метилювання ДНК
- метастазування
- оксидоредуктаза
реферат
Змінена експресія клітинних антиоксидантних ферментів, які метаболізують активні форми кисню (АФК), часто порушується при раку людини. 1, 2, 3, 4 До таких антиоксидантних ферментів належать SOD (супероксиддисмутази), які виводять супероксид (O 2 -) та каталази, та глутатіонпероксидази, які нейтралізують перекис водню (H 2 O 2). Пошкоджене видалення АФК призводить до окислювального середовища, яке сприяє збільшенню проліферації, виживаності та онкогенному прогресуванню в ракових клітинах. 1, 5 Нещодавно ми продемонстрували, що експресія позаклітинної супероксиддисмутази (EcSOD) суттєво пригнічується аберрантним метилюванням ДНК приблизно у 80% випадків раку легенів порівняно з нормальними легеневими тканинами. 6 Метилювання ДНК є одним із епігенетичних механізмів, пов'язаних з аберрантною експресією генів генів-супресорів пухлини. Оскільки EcSOD є єдиним поглиначем кисню в легенях, очікуване збільшення окисного стресу в мікросередовищі пухлини внаслідок цієї інактивації експресії EcSOD сприятиме патологічному та злоякісному прогресуванню раку легенів.
Порівняно з іншими СОД ссавців, які повсюдно експресуються, експресія гена EcSOD жорстко контролюється за типом клітин та тканинним специфічним способом. 8 Завдяки клітинній поверхні та позаклітинній локалізації EcSOD в порівнянні з цитозольним та мітохондріальним розподілом CuZnSOD та MnSOD, специфічний характер експресії EcSOD підкреслює різну біологічну роль цих SOD у тканинах. У нашому попередньому дослідженні раку молочної залози надмірна експресія EcSOD в нульових EcSOD клітинних лініях раку молочної залози призвела до ослаблення злоякісних фенотипів in vitro, включаючи зниження швидкості росту, клоногенного виживання та інвазії9, що свідчить про супресивну функцію EcSOD при раку молочної залози. Щоб краще зрозуміти роль EcSOD у підтримці окислювально-відновного гомеостазу нормальних епітеліальних клітин молочної залози молочної залози та у запобіганні окисно-опосередкованому пухлинному розвитку грудей, необхідно оцінити рівні експресії цього антиоксидантного ферменту в нормальних клітинах епітелію молочної залози порівняно зі злоякісними клітинами. епітеліальні клітини молочної залози 6 підняли фундаментальне питання про те, чи експресується EcSOD в нормальних епітеліальних клітинах молочної залози.
Для подальшого вирішення цієї проблеми з експресією EcSOD в нормальних епітеліальних клітинах молочної залози ми провели імуногістохімічне фарбування (IHC) і тепер підтвердили експресію EcSOD в епітеліальних клітинах молочної залози в нормальній тканині грудей людини, на відміну від нашого попереднього дослідження in vitro з використанням культивованих клітин. Ця розбіжність припускає, що експресія EcSOD може бути порушена, коли клітини культивували як моношар у звичайній двовимірній (2D) системі культури. Застосування тривимірної (3D) системи посівів нещодавно набрало обертів у дослідженнях раку молочної залози, оскільки воно забезпечує фізіологічно важливий стан культури тканин для рекапітуляції багатьох гістологічних особливостей епітелію молочної залози in vivo. Сюди входять утворення ациноподібних сфероїдів з порожнистим просвітом, апікальна поляризація клітин та базальне відкладення компонентів базальної мембрани, а також зображення експресії генів, специфічно пов’язаних з функцією молочної залози. 10, 11
Таким чином, метою цього дослідження було визначити експресію EcSOD у незлоякісних епітеліальних клітинах молочної залози за допомогою фізіологічно відповідної системи культури 3D та визначити механізми, що лежать в основі відмінностей у експресії гена EcSOD в одношаровій культурі порівняно з ацинарною культурою, як при клінічно набутому раку молочної залози людини . Ми виявили, що організація тканин має важливе значення для експресії гена EcSOD у незлоякісних епітеліальних клітинах молочної залози молочної залози, і що реактивація експресії гена EcSOD у клітинах, вирощених у 3D, пов'язана з епігенетичним перепрограмуванням. Крім того,> 80% обстежених пухлин молочної залози показали значно знижений рівень експресії EcSOD порівняно з нормальними тканинами молочної залози. Далі ми показали, що зниження експресії EcSOD у цих пухлинах молочної залози було пов’язане з гіперметилюванням ДНК у регуляторній області промотору EcSOD. У наших in vivo метастатичних моделях тварини, які отримували аденовірусний вектор з надмірною експресією людського EcSOD, AdEcSOD, продемонстрували значне зменшення експериментальних метастазів у легенях та спонтанних метастазів у порівнянні з порожніми мишами, обробленими векторами.
Наскільки нам відомо, це перше дослідження, яке показало "пластичність" експресії гена EcSOD у незлоякісних епітеліальних клітинах молочної залози людини (HMECs) з кінцевою життєздатністю в умовах 3D культури порівняно з 2D клітинами. Пов’язаність мовчання гена EcSOD із втратою організації тканин молочної залози in vivo свідчить про важливу роль EcSOD як супресора пухлини молочної залози. Отже, при визначенні нових терапевтичних втручань щодо цього захворювання, важливо буде додатково визначити важливість та механічну роль EcSOD у придушенні прогресування раку молочної залози.
результат
Експресія EcSOD відсутня у культивованому 2D HMEC
Щоб визначити роль EcSOD у розвитку раку молочної залози, ми оцінили рівні експресії EcSOD у культивованих не злоякісних клітинах епітелію молочної залози. Як показано на малюнку 1а, експресія мРНК EcSOD не була виявлена ні в клітинах HMEC, ні в MCF-10A порівняно з фібробластами легенів MRC5 легенів людини та первинними культурами епітеліальних клітин дихальних шляхів людини. Однак фарбування IHC виявило певне позитивне фарбування EcSOD в нормальних тканинах молочної залози, зокрема в молочному епітелії грудей (рис. 1b). Ці спостереження дозволяють припустити, що хоча нормальні епітеліальні клітини молочної залози демонстрували стійку експресію EcSOD in vivo, культивування клітин in vitro призвело до втрати експресії гена EcSOD.
Експресія EcSOD виявляється в нормальній тканині молочної залози, але не в незлоякісних клітинах молочного епітелію в одношарових культурах. a ) Загальну РНК екстрагували та аналізували на транскрипцію мРНК EcSOD із постстазового HMEC, отриманого з редукуючих мамопластів, та зі спонтанно трансформованої незлоякісної клітинної лінії молочної залози MCF-10A. Порівняно з нормальними фібробластами легенів людини (MRC5) та нормальними епітеліальними клітинами людських дихальних шляхів, клітини HMEC та MCF-10A продемонстрували невизначену експресію мРНК EcSOD, визначену за допомогою RT-PCR-аналізу в реальному часі. 18S використовувався як регулятор навантаження. Смужки помилок представляють тут n = три окремих експерименти. b ) Аналіз IHC показує позитивне фарбування EcSOD в нормальній тканині молочної залози (права панель). На лівій панелі показано фарбування H та E тієї самої нормальної тканини молочної залози.
Повнорозмірне зображення
Експресія гена EcSOD реактивується в HMEC, культивованому в 3D
Повнорозмірне зображення
3D-культивований HMEC демонструє нижчий рівень окиснення DCFH порівняно з клітинами в моношаровій культурі
Щоб визначити, чи змінюється рівень окисного стресу при культивуванні HMEC в умовах 2D порівняно з 3D культурою, ми позначили клітини флуоресцентним зондом, чутливим до окислення, DCFH. Посилене окиснення DCFH спостерігали у 2D-культивованому HMEC порівняно з клітинами, що культивували 3D, як показав аналіз проточної цитометрії на малюнку 3a (середня інтенсивність флуоресценції 2102 у 2D HMEC проти 189 у 3D HMEC). Нечутлива до окислення версія цього зонда, яка контролює поглинання барвника, розщеплення естерази та витікання, не показала різниці в інтенсивності сигналу, що вказує на те, що різниця сигналів, що спостерігається між культурами 2D та 3D, була обумовлена саме окисленням зонда (дані не наведені). Це свідчить про те, що розповсюдження незлоякісних епітеліальних клітин молочної залози як одношарової культури призвело до посилення окисного стресу, який частково можна було б пояснити втратою експресії EcSOD.
Повнорозмірне зображення
Заглушення гена EcSOD у 2D-культивованому HMEC пов'язане з гіперметилюванням промоторної ДНК
Експресія EcSOD значно знижується в клінічних тканинах раку молочної залози, а рівні її експресії мРНК корелюють протилежно клінічній стадії
Ми також прагнули визначити рівні експресії EcSOD у клінічних зразках раку молочної залози. Як показано на репрезентативних зображеннях фарбування EcSOD IHC на малюнку 4а, ми виявили сильну і остаточну експресію білка EcSOD у клітинах епітелію молочної залози в доброякісній часточці. Навпаки, імунореактивність EcSOD помітно знижується при високопротоковій карциномі in situ та при інвазивному раку молочної залози. Інтенсивність фарбування IHC для EcSOD у нормальних тканинах молочної залози порівняно з неопластичними була напівкількісно визначена і показана в таблиці 1. Для подальшого вивчення того, чи є порушена експресія EcSOD поширеною подією при раку молочної залози, ми провели поле кДНК раку молочної залози TissueScan (Origene, Inc ., Роквілл, штат Медіка, США). Як показано на малюнку 4b, спостерігалося зниження рівня експресії мРНК EcSOD стадії та значне зниження стадій II до IV порівняно з нормальними тканинами (P
Надмірна експресія EcSOD пригнічувала утворення зірчастих колоній клітин MDA-MB231 в 3D культурі. Двовимірні культивовані MDA-MB231 інфікували AdEmpty, AdEcSOD або AdAHBD при moi = 50 PFU/клітина протягом 24 годин з подальшим пересіванням клітин у 3D культуру. Після 5 днів 3D-культури клітини MDA-MB231 утворили великі колонії з обширними зірчастими структурами, що є ознакою тривимірного фенотипу «інвазивного» раку молочної залози. Хоча AdEmpty не впливав на 3D-морфологію цієї клітинної лінії, надмірна експресія EcSOD, як у повнорозмірних, так і в усічених формах (з аденовірусною інфекцією AdEcSOD та AdAHBD, moi = 50 PFU/клітина), призвела до набагато менших колоній без формування. морфологічні зміни спостерігалися, коли клітини MDA-MB231 генерувались для стабільної експресії EcSOD, при Ec.20 (повна довжина) та AHBD.3 (делеція у HBD), де клітини утворювали невеликі колонії за відсутності подовження зірок. = 3. Шкала колон = 100 мкм.
Повнорозмірне зображення
Надмірна експресія EcSOD пригнічує експериментальні метастази в легенях клітин MDA-MB231 та тривале виживання тварин
Придушення метастазів у легенях клітинами MDA-MB231.luc за допомогою EcSOD. Для індукування метастазів у легені 2 х 106 MDA-MB231.luc клітин вводили у бічну хвостову вену у голих атимічних мишей. Надмірна експресія EcSOD була досягнута за допомогою AdEcSOD або AdAHBD (1 x 10 10 PFU), введених внутрішньом’язово за 3 дні до ін’єкції клітин раку молочної залози. AdEmpty використовувався як векторний елемент управління. ( a, Верхня панель) Репрезентативні біолюмінесцентні зображення мишей, зроблені відразу після ін’єкції клітин MDA-MB231.luc. ( a, Нижня панель) Мишей знімали дорсально і вентрально щотижня для моніторингу метастазування клітин раку молочної залози. Групи, які отримували EcSOD, продемонстрували знижений розвиток метастазів у легенях порівняно з групою, зараженою AdEmpty. Ось зображення часового ходу однієї і тієї ж тварини в кожній групі. ( b ) Люмінесцентний сигнал (потік фотонів) метастатичних клітин MDA-MB231.luc був побудований з часом, демонструючи значне пригнічення метастазів у легенях AdEcSOD та AdAHHD порівняно з AdEmpty (P
Інгібування спонтанних метастазів клітинної лінії карциноми молочної залози за допомогою EcSOD. a ) Репрезентативні зображення біолюмінесценції, що демонструють прогресування клітин раку молочної залози миші 4T1.luc у мишей BALB/c на 10 день після імплантації пухлини (1), через 7 днів після видалення пухлини (2) та метастазування в легені та лімфатичні вузли через 4 тижні після пухлини видалення (3).). b ) Виникнення метастазування клітин 4T1.luc у вторинні ділянки (легені та лімфатичні вузли) оцінювали та показували як відсоток метастазів. ( c ) Коефіцієнт виживання тварин Каплан-Мейєра, трансдукованих AdEmpty, AdEcSOD та AdAHBD, був побудований із використанням статистики призми з днями, що минули після хірургічного видалення первинних пухлин 4T1.luc. Крива виживання для AdEcSOD та AdAHBD суттєво відрізнялася (Р 15, який пізніше припустив, що секретований СОД може відігравати важливу роль у підтримці стабільності білка молока, запобігаючи пошкодженню окислювального білка. 16 Тут ми переконливо продемонстрували експресію EcSOD в нормальній молочній залозі людини та в просвіті епітеліальні клітини, ймовірно, є джерелом виведення цього ферменту з молоком.
Далі ми показали, що HMEC втрачає експресію EcSOD при культивуванні як моношар, і ця зміна регулюється епігенетичним механізмом, коли метилювання області ДНК промотору EcSOD відбувається в 2D-культивованому HMEC (Рисунок 3d). Гіперметилювання острівців CpG у промоторній області гена визнано важливим епігенетичним механізмом транскрипційного мовчання регуляторних генів пухлини, у багатьох випадках генів-супресорів пухлини, під час розвитку раку. Той факт, що експресія гена EcSOD жорстко контролюється за клітинним типом 8, і його промотор показує структуру CpG, подібну до іншого гена, замовчуваного аномальним метилюванням цитозину 18, свідчить про можливу зв'язок епігенетичної регуляції через метилювання ДНК з EcSOD ген. експресія в клітинах епітелію молока. Ослаблення гена EcSOD за допомогою метилювання ДНК є оборотним процесом, таким як морфогенез акрара, опосередкований реактивацією експресії гена EcSOD, індукованою lrECM HMEC, у 3D-культивованому HMEC.
Важливо зазначити, що модель HMEC, використана в цьому дослідженні, була отримана з комерційного джерела, яке зазнало стазу або спричиненого стресом старіння. 19 Хоча ці пост-стадії HMEC все ще мають обмежений термін життя і не є злоякісними, було показано, що вони набули сотні транскрипційних та епігенетичних змін під час їх відбору. 20, 21 Це свідчить про те, що втрата експресії EcSOD, яка спостерігається у нашому 2D-культивованому HMEC, можливо, була ініційована під час прогресування клітин через цей стазовий виклик, і що клітини до стадії все ще можуть зберігати експресію EcSOD.
Спостереження про те, що втрата тканин молока (як у одношаровій культурі HMEC) сприяє епігенетичному приглушенню EcSOD, також суттєво підтверджується і тісно відображається в наших клінічних даних, оскільки більшість пухлин молочної залози демонструють значно знижений рівень експресії EcSOD порівняно з нормальною тканиною молочної залози. Регіон, проаналізований за допомогою аналізу COBRA (рис. 4в), відповідає регуляторному ділянці факторів транскрипції SP1/SP3, які, як було показано, сприяють експресії EcSOD, і які ми нещодавно виявили гіперметильованими в наших дослідженнях раку легенів. Метилювання сайтів CpG в цій області перешкоджає зв'язуванню цих факторів транскрипції та створює більш замкнуту структуру хроматину, що призводить до репресивного стану експресії EcSOD.
Загалом, це дослідження чітко демонструє експресію EcSOD у нормальних епітеліальних клітинах молочної залози in vivo та у 3D культивованих HMEC. Однак, якщо часточна архітектура порушується, наприклад, при пухлинах молочної залози та у культивованому HMEC моношарі, ген EcSOD замовчується за рахунок аберрантного метилювання цитозину. Ці захоплюючі спостереження також свідчать про те, що посилення активності поглинання АФК, наприклад, з використанням міметиків СОД, можна дослідити як терапевтичну стратегію при метастатичному раку молочної залози. Подальше підтвердження причинно-наслідкової ролі приглушення гена EcSOD у сприянні прогресуванню раку молочної залози та метастазуванню буде, таким чином, критично важливим для виявлення втрати експресії EcSOD як прогностичного біомаркера для ранньої діагностики та нових методів лікування.