- Резюме
- Вступ
- Результати
- Ідентифікація фосфопротеїнів у клітинах SNU216 та SNU216-LR
- Мережевий аналіз та кількісна оцінка диференційовано фосфорильованих білків
- Вплив спрямованих протипухлинних засобів на клітини SNU216-LR
- Обговорення
- Додаткова інформація
- Файли зображень
- Додаткова фігура 1
- Додатковий малюнок 2А
- Додатковий малюнок 2B
- Додатковий малюнок 3
- Додаткова фігура 4
- Додатковий малюнок 5
- Файли PDF
- Додаткова таблиця 1
- Додаткова таблиця 2
- Додаткова таблиця 3
- Документи Word
- Додаткова інформація
Резюме
Вступ
Рецептор 2 епідермального фактора росту людини (HER2) є однією з рецепторних тирозинкіназ, що активується димеризацією з представниками сімейства рецепторів епідермального фактора росту (EGFR). 1 Надмірна експресія HER2 призводить до прогресування пухлини через внутрішньоклітинні каскади трансдукції сигналу 2 і спостерігається у ~ 20-30% випадків раку молочної залози з високим ризиком, 3, 4, а також у 6 -35% інвазивних раків шлунка. 5 Лапатиніб пригнічує проліферацію EGFR та/або HER2, що надмірно експресує ракові клітини, як in vitro, так і in vivo, і був схвалений Управлінням з контролю за продуктами та ліками США як лікування передового HER2 позитивного раку молочної залози у 2007 р. 6,7,8 Протипухлинна активність лапатинібу також досліджували в клітинах раку шлунка. 9,10 В даний час проводиться клінічне випробування III фази, в якому порівнюється ефект лише хіміотерапії та комбінації з лапатинібом у пацієнтів із HER2-позитивним раком шлунка. 11 Однак придбана резистентність до лапатинібу була і залишається обмеженням для його терапевтичного використання в клініці через погане розуміння основних механізмів.
Результати
Ідентифікація фосфопротеїнів у клітинах SNU216 та SNU216-LR
Щоб дослідити потенційні механізми, відповідальні за набуття стійкості до терапії, спрямованої на HER2, при раку шлунка, ми встановили клітинну лінію LR (SNU216-LR) шляхом хронічного впливу на HER2-позитивні клітини SNU216 (гіперчутливі до лапатинібу клітини раку шлунка) до зростаючих концентрацій лапатинібу. in vitro протягом 8 місяців. Було відібрано та охарактеризовано один клон клітини LR (SNU216-LR). Значення наполовину максимальної інгібуючої концентрації в клітинах SNU216-LR становило> 10 мкМ, що в 500 разів вище, ніж у батьківських клітин (0,02 мкМ).
Потім ми провели широкомасштабний кількісний аналіз фосфопротеомів для виявлення диференційовано фосфорильованих білків (DPP) між клітинами SNU216-LR та SNU216. MS-аналіз фосфопептидів, збагачених TiO 2 (білок: ймовірність> 99% та FDR 80% та FDR 20). Наш підхід виявив 7791 сайт фосфорилювання (бал> 80%) серед 11 852 унікальних місць фосфорилювання (Додаткова таблиця 3). виявлено, що це найбільш залишковий фосфорильований залишок (9745 ділянок, 82%), за ним слідують треонін (1763 ділянки, 15%) і тирозин (344 ділянки, 3%) (Додаткова фігура 1В). Відтворюваність виявлення тих самих білків у трьох повторностях аналіз за допомогою LC-MS/MS перевищив 91% для обох клітинних ліній (додаткові фігури 1C та 1D).
Щоб оцінити кількісні зміни у фосфорилюванні кожного фосфопептиду, ми відібрали для DPP у клітинах SNU216-LR, використовуючи метод спектрального підрахунку Scaffold (версія 3.4.9). Співвідношення сигнал/шум та значення P для DPP були отримані за допомогою PLGEM. Список з 95 суттєво регульованих фосфопротеїнів (P
Диференціально експресовані фосфопротеїни в SNU216-LR та їх функціональні анотації. ( до ) Ділянка вулкана, що показує значення P (−log 10) проти сигналу/шуму (S/N) фосфопротеїнів, визначеного статистичним аналізом моделі глобальної похибки закону потужності (PLGEM) для немеченого кількісного визначення. ( b ) Молекулярні функції фосфопротеїнів, виявлені за допомогою інструменту аналізу шляху винахідливості (IPA). ( c ) Субклітинна локалізація фосфопротеїдів, виявлена засобом IPA.
Повнорозмірне зображення
Далі ми оцінюємо кількісні зміни у фосфорилюванні білка, використовуючи методи без кількісного визначення (спектральний підрахунок MS/MS та екстракційна іонна хроматографія), які є загальноприйнятими у фосфопротеомічних дослідженнях. 22, 23, 24 Більше спектрального підрахунку MS/MS фосфорильованих пептидів EGFR та HER2 було виявлено в SNU216-LR, ніж у клітинах SNU216 (додаткові малюнки 2A та 2B). Ці дані узгоджувалися з екстрагованою пептидом іонною хроматограмою, яка показала значно вищу інтенсивність сигналу фосфорильованих пептидів у клітинах SNU216-LR (додаткові малюнки 2C та 2D). Використовуючи ті самі підходи до кількісного визначення, нам вдалося виміряти рівні фосфорилювання ключових молекул (MET, RAS, C-RAF, ERK1/2, PI3K та AKT; див. Додаткові малюнки 2E-J). Крім того, ми знайшли новий сайт фосфорилювання в HER2 (S1073) на основі довідкової бази даних фосфопептидів phosphoSitePlus (www.phosphosite.org). Це місце фосфорилювання було підтверджено відповідними тандемними мас-спектрами, показаними на додатковому малюнку 3.
Мережевий аналіз та кількісна оцінка диференційовано фосфорильованих білків
Щоб дослідити, наскільки активація сигнальних шляхів сприяє терапії, спрямованій на EGFR/HER2, ми інтегрували DPP (P
Аналіз біологічних мереж фосфопротеїдів. Асоціації між фосфопротеїнами показані суцільними або пунктирними лініями, що представляють пряму або непряму взаємодію відповідно. Нерегульовані білки показані червоним кольором, а негативно регульовані білки - зеленим.
Повнорозмірне зображення
Наш аналіз результатів інструменту IPA також показав, що сигнальні шляхи EGFR/HER2, MET та ERK/MAPK були збагачені (додаткова фігура 5). На основі результатів аналізу мережі та канонічного сигнального шляху ми побудували сигнальну мережу для EGFR/HER2 та MET з двома основними вихідними сигнальними шляхами (PI3K/AKT та MAPK/ERK), включаючи SRC. (Рисунок 3) . Як показано на малюнку 3а, категоризація рівнів експресії конкретних фосфорильованих ділянок показала, що більшість сигнальних молекул були високо експресованими в SNU216-LR. Ми також порівняли SNU216 і SNU216 LR, а також три інших стійких клони (SNU216-LR1, 2 і 3), використовуючи імуноблот-аналіз з фосфоспецифічними антитілами. За кількісними результатами МС, рівень фосфорилювання вибраних білків (EGFR, HER2, MET, AKT, MAPK, SRC та RAF) збільшився у SNU216-LR (рис. 3b).
Повнорозмірне зображення
Вплив спрямованих протипухлинних засобів на клітини SNU216-LR
Антипроліферативні ефекти вибраних інгібіторів тирозинкінази на SNU216-LR. Клітини SNU216-LR обробляли одноразовою або комбінованою обробкою лапатинібом (Lap; 1 мкМ), NVP-BEZ235 (BEZ; 100 нМ), селаметинибом (Selu; 1 мкМ), саракатинібом (Sara; 1 мкМ) та кризотинібом (Crizo; 1 мкМ). ( до ) Життєздатні клітини вимірювали через 72 год. Відсоток життєздатних клітин показаний відносно необроблених контролів. Дані представляють середнє значення ± sd (* P 9 В даний час триває клінічне випробування фази III у пацієнтів із запущеним раком шлунка, яке вивчає ефекти лапатинібу у поєднанні з капецитабіном та оксаліплатином. 26 Інтерес до цього дослідження свідчить про те, що лапатиніб вважається одним із перспективні хіміотерапевтичні препарати для лікування раку шлунка. З іншого боку, середня тривалість реакції на лапатиніб становить 27 Отже, розуміння механізмів стійкості до придбаного лапатинібу може допомогти поліпшити терапевтичну ефективність лапатинібу при HER2-позитивних ракових пухлинах.
Виявивши конститутивну активацію в клітинах раку шлунка LR сигнальних шляхів PI3K/AKT та MAPK/ERK, а також активацію SRC, ми висунули гіпотезу, що конститутивна активація PI3K/AKT та MAPK/ERK надає стійкість до лапатинібу і може бути опосередкованою Сигналізація осі MET вздовж двох основних нижніх шляхів. Наші дані узгоджуються з поняттям компенсаторної активації сигнального шляху низхідної клітини, опосередкованого MET у відповідь на блокування EGFR. 30, 31 Результати кількох досліджень показали, що активація MET пов'язана з первинною та набутою стійкістю до інгібіторів EGFR при недрібноклітинному раку легені. 14, 15, 32, 33 Тому ми постулюємо, що конститутивна активація сигнальних шляхів PI3K/AKT та MAPK/ERK осі MET, включаючи бічну активацію SRC, є компенсаторним сигнальним каскадом, який протидіє селективному тиску на EGFR/HER2 на LR ракові клітини шлунка людини.
У цьому дослідженні ми виявили, що лікування лікування лапатинібом та кризотинібом здатне викликати чутливість до лапатинібу. Отже, активні сигнальні шляхи PI3K/AKT та MAPK/ERK, індуковані віссю MET, можуть бути критичною компенсаторною внутрішньоклітинною подією для виживання клітин LR. 28 Наскільки нам відомо, це дослідження є першим широкомасштабним профілем фосфорилювання пептиду/білка в клітинних лініях раку шлунка для вивчення стійкості до лапатинібу. Наш напівкількісний та специфічний для конкретного місця підхід демонструє корисне застосування біоінформатики, а фосфопротеомічні дані дослідження дають інформацію, що має безпосереднє відношення до механізмів стійкості до лапатинібу.
На закінчення ми демонструємо, що глобальний фосфопротеомічний аналіз, що базується на мережі, є надійним підходом для прогнозування подій сигналізації клітин у клітинах раку шлунка LR. Отримані нами результати дозволяють припустити, що зумовлені MET методи PI3K/AKT та MAPK/ERK сигнальних шляхів сприяють стійкості до лапатинібу, і складові сигнальні молекули можуть бути потенційними мішенями для розвитку додаткових терапевтичних варіантів. Отже, обґрунтованість сигнальних шляхів осі MET PI3K/AKT та MAPK/ERK слід оцінювати за допомогою клінічних зразків і буде предметом подальшого дослідження.