предметів

реферат

Функцію генів біосинтезу хатомарубігіну аналізували за допомогою гетерологічної експресії кластера генів hrb. Встановлено, що Streptomyces lividans, що містить генний кластер, що складається з 25 генів (hrbR1 - hrbX) з hrbY, продукує всі відомі хатомарубігіни, включаючи хатомарубігін D, який має унікальний димерний ангуциклін з метиленовим зв'язком. У цій гетерологічній експресійній системі генні розлади використовувались для аналізу функції hrbF, гена без гомології з відомими генами біосинтезу ангуцикліну. Новий метаболіт був виявлений у ферментованому середовищі S. lividans, що експресує гени hrb без hrbF, і був позначений як хатомарубігін F. Ця сполука була визначена як 5-гідроксихатомарубігін Е за допомогою ЯМР-спектроскопічного аналізу, що вказує на те, що HrbF регулює регіональну специфічність окислювальних ферментів.

Хатомарубігіни A, B, C і D (рис. 1), речовини, які піддаються реверсивному впливу на різні лікарські засоби, були вироблені Streptomyces sp. 2238-SVT4. 1 Хатомарубігін Е та рубігінон В2 також були знайдені у ферментованому бульйоні як біосинтетичні проміжні продукти. Ці сполуки належать до групи ангуциклінів, 3, 4, яка характеризується тим, що вона містить модифікований скелет бенз [а] антрахінону. Серед них хатомарубігін D являв собою унікальний димерний ангуциклін з метиленовим зв’язком. У нашому попередньому дослідженні 5 хатомарубігінів, крім хатомарубігіну D, були вироблені Streptomyces lividans, несучи кластер генів, що складається з 25 генів (hrbR1 - hrbX), щоб ідентифікувати ген кластера горба (рис. 2) як гени біосинтезу хатомарубігіну. Така гетерологічна експресійна система корисна для функціонального аналізу невідомих генів у кластері. У цьому дослідженні всі відомі хатомарубігіни, включаючи хатомарубігін D, були отримані шляхом гетерологічної експресії генів 25 hrb з hrbY, а хатомарубігін F, новий член сімейства хатомарубігінів, був виділений з ферментованого міцелію S. lividans, що несе відсутній hrbF скупчення. .

функціональний

Структури гатомарубігінів від А до F та рубігінону В2.

Повнорозмірне зображення

Кластер генів біосинтезу хатомарубігіну від Streptomyces sp. 2238-SVT4. Стрілки позначають фрагменти ДНК, що використовуються для гетерологічної експресії. Сірі рамки позначають гени, гомологічні відомим генам біосинтезу ангуцикліну.

Повнорозмірне зображення

Результати і обговорення

Експресія кластера генів hrb, що містить hrbY, у S. lividans

Наше попереднє дослідження визначило HrbY як фермент, який може перетворювати хатомарубігін С у хатомарубігін D у присутності метилкобаламіну. Щоб підтвердити in vivo функцію HrbY, ми сконструювали pWHM3-HR-Y, плазміду, що несе гени 25 hrb (hrbR1 - hrbX) з hrbY. Всі відомі хатомарубігіни, включаючи хатомарубігін D, були виявлені за допомогою ВЕРХ-аналізу ферментованого відвару S. lividans, що несе pWHM3-HR-Y, хоча гени S. bividans, що експресують гени горба без горба, не продукували хатомарубігін D (рис. 3). Ці результати показали, що HrbY функціонує in vivo і що генний кластер біосинтезу хатомарубігіну існує в області від hrbR1 до hrbR3, гена, гомологічного ядерному регулятору (61% ідентичності). 5

ВЕРХ-аналіз міцеліального екстракту S. lividans, що несе pWHM3-HR5 ( a ); pWHM3-HR-Y ( b ); pWHM3-HR-YF ( c ) та pWHM3-HR-YFF-F ( d ). 1: хатомарубігін F, 2: хатомарубігін В, 3: хатомарубігін А, 4: хатомарубігін С, 5: хатомарубігін Е, 6: хатомарубігін D.

Повнорозмірне зображення

У експресії кластерного гена hrb відсутній hrbF у S. lividans

Кластер генів горба містить кілька генів без гомології з відомими генами біосинтезу ангуцикліну (рис. 2). Серед них, hrbF кодує 234-амінокислотний білок, що виявляє незначну схожість з біосинтезом антибіотика монооксигенази S. griseus NBRC13350 SGR_5610 (34% ідентичності) та біосинтезом убіхінону/менахінону метилтрансферази від Caulobacter crescentus CB15 (ідентичність 34%). Щоб дослідити функцію hrbF, ми сконструювали pWHM3-HR-YF, плазміду, яка може експресувати кластер генів hrb без бракуючого hrbF. Ферментований міцелій S. lividans, що несе pWHM3-HR-YF, містив усі хатомарубігіни, що вказує на те, що hrbF не є важливим для біосинтезу хатомарубігіну. Коли профілі ВЕРХ порівнювали з профілями S. lividans, що експресували весь кластер генів zhb hrb, був виявлений новий метаболіт і пік зник у трансформаторному відварі, який вводився в hrbF (рис. 3). Ця речовина була визначена як новий член сімейства хатомарубігінів за допомогою спектроскопічного аналізу та позначена як хатомарубігін F ( 1 ).

Визначення структури хатомарубігіну F (1) \ t

Стіл в натуральну величину

ЯМР-аналіз хатомарубігіну F ( 1 ). Жирними лініями позначені мережі COSZY, а стрілками - HMBC.

Повнорозмірне зображення

Streptomyces sp. 2238-SVT4 продукував рубігінон В2, який можна перетворити в хатомарубігіни А і В шляхом окислення до С-6 і С-11. У кластері hrb два тандемні гени, hrbW і hrbX, що кодують оксидоредуктазу та оксигеназу, беруть участь у 11-гідроксилюванні. Передбачувана оксигеназа, відповідальна за 6-гідроксилювання, пов'язана з hrbG. Порушення hrbF спричинило оксигенацію в ненормальному положенні C-5 та зменшило вироблення хатомарубігіну А (рис.3), що свідчить про те, що HrbF контролює регіональну специфічність цих окислювальних ферментів.

Експериментальний розділ

Штами бактерій та маніпуляції з ДНК

Середні та умови росту Streptomyces sp. 2238-SVT4 та S. lividans TK23 були описані вище. 1,5 Escherichia coli XL1-blue MRF 'та JM110 вирощували у середовищі LB, доповненому 100 мкг мл-1 ампіциліну. ДНК-полімераза KOD-плюс (Тойобо, Осака, Японія) була використана для ампліфікації ПЛР згідно з інструкціями виробника. Інші загальні процедури проводили, як описано у Sambrook et al. 8

Побудова плазмід для кластерної експресії

Фрагмент 19,8 кбіт, що складається з hrbR1 до hrbS (HR01), був сконструйований, як описано вище. Фрагмент 5,2 кбіт, що складається з hrbT до hrbX (HR02), ампліфікували з Streptomyces sp. 2238-SVT4 геномна ДНК з використанням праймерів з додатковими сайтами Nsi I та Nhe I (5'-TGCATGCATGTGCGAGAGCGCTGGACGCACGC-3 'та 5'-ACCGCTAGCTCAGACGGACAGCAGCCCGCGTGC-3'). Фрагмент горбка 1,1-KBP (HR03) ампліфікували з геномної ДНК, використовуючи праймери з додатковими сайтами NheI та HindIII (5'-ACCGCTAGCATGAGTGCAACAGTCGCGGTCGTC-3 'та 5'-ACCAAGCTTTCAGCCGGCGGTGGGCCGAACTG-3). HR01, розщеплений Xba I/Nsi I, HR02, розщеплений Nsi I/Nhe I, розщеплений HR03 з NheI/Hin dIII і розщеплений pWHM3, розщеплений XbaI/Hin dIII, лігували до конструкції pWHM3-HR-Y, плазміди, що несе hrbR1 до hrbX s. У цій плазміді може транскрибуватися hrbA до hrbY.

Порушення hrbF проводили, як описано нижче. Фрагмент Not I/Pst I 3,1 кбіт, що містить hrbF, клонували у pBluescript II SK (+) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Фрагмент 1,2 kbp перед hrbF ампліфікували з плазміди, використовуючи праймер R13 M13 і праймер з іншим сайтом Bln I (5'-AACCTAGGCGTCTTTCACTCCCGGTGTCGTCG) і перетравлювали NotI та Bln I. Фрагмент 1,2 kbp нижче за течією hrbF ампліфікували за допомогою M13 праймер М4 і праймер з додатковим сайтом Bln I (5'-AGCCTAGGGCGCGCAGGTCGGCCCCAGAAGGA-3 ') і перетравлюються за допомогою Pst I і Bln I. Ці два фрагменти лігували до засвоєного Not I/Pst I pBluescript II SK (+), HrbF- видалено Фрагмент 2,4 kbp, отриманий перетравленням плазміди Not I/Pst I, обмінювались із оригінальним фрагментом Not I/Pst I 3,1 kbp pWHM3-HR-Y для побудови pWHM3-HR-YF. Фрагмент 0,7 kbp hrbF ампліфікували з геномної ДНК, використовуючи праймери з додатковими сайтами Bln I (5'-GACCTAGGATGCCTGTAGCCTCCGACGCCCCA-3 'і 5'-CGCCTAGGTCAGTCGGCTGTCTTCTCCAGCGC-3'), і p1-HbFHR знову вводили в HbMG-hr однакова орієнтація на конструкцію pWHM3-HR-YFF-F для додаткового аналізу hrbF .

Гетерологічна експресія генів біосинтезу хатомарубігіну

Експресійні плазміди, пройшли через E. coli JM110, вводили в S. lividans TK23. Трансформантів інокулювали в середовище інокуляту, що містить 10,3% сахарози, 3,0% глюкози, 1,5% Bacto Soytone, 0,1% гліцину, 3 мМ CaCl 2, 5 мМ MgCl 2 і 10 мкг мл-1 тіострептону (pH 7, 2). Після інкубації на поршневому шейкері при 27 ° C 2 мл культури посівного матеріалу переносили в 500-мл колби Ерленмейера з 50 мл продуктів, що містять 2,5% розчинного крохмалю, 1,5% соєвого борошна, 0,2% сухих дріжджів, 0,2% 4% CaCO 3 і 10 мкг мл-1 тіострептону (рН 6, 2). Ферментацію проводили на роторному шейкері при 27 ° С протягом 2-3 днів. Ферментаційний бульйон центрифугували і міцелій екстрагували ацетоном. Після випаровування водний концентрат екстрагували етилацетатом. Екстракт аналізували за допомогою ВЕРХ із зворотною фазою (YMC-Pack R-ODS-7, 4,6 мм х 250 мм; YMC, Кіото, Японія) з 80% метанолом. Піки поглинання для хатомарубігінів були виявлені при 470 нм.

Ізоляція хатомарубігіну F (1)

Міцелій отримують центрифугуванням 2-денного ферментованого середовища (5 літрів) S. lividans TK23, що несе pWHM3-HR-YF, і екстрагують ацетоном. Екстракт концентрували і розподіляли між етилацетатом і водою. Органічний шар упарюють і розчиняють у хлороформі. Осад розчиняли в метанолі додаванням 10 обсягів гексану і фільтрували. Фільтрат піддавали ВЕРХ (упаковка YMC D-ODS-7, 20 мм х х 250 мм; YMC) з використанням 80% метанолу-0,2% фосфорної кислоти. Один з основних піків (утримуючий об'єм: 280 мл) додатково очищали за допомогою ВЕРХ (упаковка YMC D-ODS-7) за допомогою 75% метанолу, що містить 5 мМ цитрату водню натрію. Основну фракцію (утримуючий об'єм: 395 мл) випаровували і водний концентрат екстрагували етилацетатом. Екстракт промивали водою і концентрували насухо, отримуючи апельсиновий порошок 1 (1,2 мг).

Фізико-хімічні властивості хатомарубігіну F (1) \ t

т.пл. 276-278 ° С; Висока роздільна здатність EI-MS m/z 340.0948 (M +, розраховано для C 19 H 16 O 6, 340.0947); УФ λ макс. (Λ) 224 нм (20 300), 287 нм (18 000), 475 нм (6800) у метанолі, 226 нм (22 000), 287 нм (20 000), 474 нм (7 000) при 0, 01 М HCl- метанол, 240 нм (14 200), 310 нм (15 000), 534 нм (8300) в 0,01 М NaOH-метанолі; ІЧ (ATR) νmax 3438, 3127, 1619, 1568, 1449, 794 см-1 .

Спектроскопічні вимірювання

Мас-спектри отримували на спектрометрі JMS-SX102A (JEOL Ltd., Токіо, Японія) в режимі EI. Спектри УФ та ІЧ вимірювали на спектрометрах Shimadzu UV-1700 та JASCO FT/IR-410. ЯМР-спектри отримували в DMSO-d6 на спектрометрі JEOL JNM-LA400 з 1 H-ЯМР при 400 МГц і 13 C-ЯМР при 100 МГц. Повідомляється про хімічні зрушення в ppm щодо DMSO при 2,49 ppm для 1 H-ЯМР та при 39,5 ppm для 13 C-ЯМР.