предметів

реферат

Метою цього дослідження було дослідити корисність послідовності нового покоління (NGS) великої кількості генів, асоційованих із серцевими каналопатіями та кардіоміопатіями, у групі з 61 жертви SUD в судово-медичному середовищі в Данії.

генетичне

Матеріали і методи

Навчання населення

У період з 2009 по 2011 роки 348 молодих (1-50 років) померлих осіб, які, як вважали, померли від природних причин, були розкриті в розділі судово-медичної патології кафедри судової медицини факультету охорони здоров'я та медицини Університету Копенгагена. З них 142 особи були класифіковані як SCD, включаючи випадки з негативним розтином. Загалом 61 особа померла раптово, несподівано та без патогенних знахідок після ретельного макро- та гістопатологічного дослідження. Токсикологічний скринінг не виявив жодного препарату на токсичному рівні, який міг би пояснити смерть у будь-якому з цих випадків. Решта 81 випадків були досліджені в попередніх дослідженнях щодо інших серцевих причин смерті. Двадцять суб'єктів були класифіковані як кардіоміопатія (правошлуночкова аритмогенна кардіоміопатія (ARVC) = 14, гіпертрофічна кардіоміопатія (HCM) = 6), 52 суб'єкти, які мали недіагностичні структурні аномалії серця у 15 та 9, як раптова несподівана дитяча смерть. 16

Генетичне тестування

До цього часу ми описали методи генетичних досліджень у Hertz et al. Коротко кажучи, ДНК було вилучено з цільної крові 57 осіб за допомогою набору QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Stockach, Німеччина). ДНК виділяли із свіжозаморожених м’язів одного суб’єкта та свіжозамороженої тканини селезінки у трьох суб’єктів за допомогою набору дослідників ДНК EZ1 (Qiagen). Вилучену ДНК кількісно визначали за допомогою набору для кількісного визначення кількості ДНК людини (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) згідно з протоколом виробника. ДНК з двох зразків ампліфікували цілим геномом за допомогою набору REPLI-g Midi (Qiagen) відповідно до протоколу виробника через низьку концентрацію ДНК.

NGS був використаний для дослідження 100 генів, раніше виявлених асоційованими із спадковою хворобою серця та SCD (табл. 1). Гени були відібрані з доступної літератури в PubMed та Online Mendelian Inheritance in Man (//omim.org/).

Стіл в натуральну величину

SureDesign (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США) був використаний для проектування зондів для цільових регіонів екзонів та UTR з 100 генів для системи збагачення цільової системи Haloplex на 150 bp (Agilent Technologies). Дизайн включав усі кодуючі екзони, 25 bp суміжних інтронів та 5'- та 3'-UTR-області від 100 бажаних генів до загалом 2076 областей із загальним розміром 787,943 bp. Загалом 99,6% цілі було охоплено> 50 ×. Два екзони недостатньо охоплені секвенуванням, а сім екзонів не секвенувались через відсутність конструкції зонда. Подробиці геномних регіонів, які недостатньо охоплені, можна знайти в Додатковій таблиці S1. Середнє охоплення ампліконів становило 950 (діапазон: 206 - 3065).

Протокол цільового збагачення Haloplex, версія D.5, використовувався відповідно до інструкцій виробника. Протокол включав наступні етапи: (1) перетравлення 200 нг геномної ДНК з різними рестрикційними ферментами у восьми пробірках та аналіз фрагментів за допомогою біоаналізатора 2100 (Agilent Technologies); (2) гібридизація перетравленої ДНК до зондів Haloplex з кінцями зондів, які були комплементарними фрагментам-мішеням. Під час гібридизації фрагменти циркулювали та включали індекси, мотиви послідовностей та біотин; (3) цільова ДНК була захоплена магнітними кульками Haloplex; (4) ніки в циркуляризованих фрагментах були закриті лігуванням; та (5) элюирование NaOH, ампліфікація ПЛР, очищення та остаточне елюювання трис-HCl-буфером захопленої цільової ДНК. Після складання бібліотеки кількість ДНК вимірювали за допомогою флуорометра Qubit 2.0 з аналізом dsDNA HS (Invitrogen, Life Technologies Europe BV, Nærum, Данія). Розподіл розміру ДНК аналізували за допомогою біоаналізатора 2100 та набору ДНК високої чутливості (Agilent Technologies). Всі зразки секвенували на MiSeq (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) згідно з рекомендаціями виробника з парним кінцевим секвенуванням на 150 bp, використовуючи MiSeq Reagent Kit V2 (300 циклів).

Аналіз даних та біоінформатика

До цього часу ми детально описали аналіз даних у Hertz et al. Коротко, файли fastq, створені MiSeq, використовувались для подальшого вирівнювання та аналізу. SureCall (Agilent Technologies) використовувався для аналізу базових дзвінків за допомогою стандартних налаштувань та їх стандартного алгоритму. Повний перелік ідентифікованих варіантів було подано у форматі "Виклик варіантів".

Alamut Batch v.1.2.0 та Alamut Visual v.2.5 (Interactive Biosoftware, Руан, Франція) використовувались для анотації та оцінки варіантів, як описано в Hertz et al. Варіанти оцінювались за допомогою (1) аналітичного інструменту in vitro, розробленого для визначення ймовірності патогенності варіанта та (2) частоти 17

Варіант був класифікований як невідомий за значенням у випадку частоти вище поширеності захворювання згідно з наявною літературою, неконсервативного заміщення амінокислот, багаторазового спостереження варіанту в когорті або відсутності значної зв'язку з будь-якими захворюваннями серця та нуклеотидами в регіони, де був знайдений варіант.

Гени та варіанти ДНК були пронумеровані відповідно до еталонних послідовностей, використаних у Таблиці 1, за допомогою номенклатури HGVS (www.HGVS.org). Варіанти були подані до бази даних Лейденської відкритої варіації (//databases.lovd.nl/shared/individuals, Ідентифікаційний номер особи: 00064702–00064741).

Покриття обчислювалось за допомогою сценарію python, який обчислює покриття для кожного амплікона за допомогою Bedtools покриття Bed. Амплікони, де в усіх зразках було 23, використовувались для проведення статистичного аналізу та оцінки варіантів в аналізі silico за допомогою спеціального сценарію.

Етичні стандарти

Дослідження було схвалено Комітетами з етики досліджень охорони здоров’я Данії (H-2-2012-017) та Датським агентством із захисту даних (2011-54-1262).

результат

Навчання населення

Ми включили 61 особу, яка після ретельного медичного обстеження раптово та несподівано померла без патогенних знахідок та була класифікована як SUD. Середній вік смерті становив 39 років (діапазон 1-50) та 43 (70%) чоловіків (таблиця 2). Посмертні токсикологічні дослідження були проведені в 54 (89%) випадках, з яких 16 (30%) були негативними. У жодному з цих випадків не було виявлено жодного препарату в токсичній концентрації, який міг би пояснити смерть.

Стіл в натуральну величину

Дві померлі особини (3%) мали сімейну історію захворювань серця. Батько однієї особи помер у віці 56 років від неуточненої серцевої причини. У цієї особи не було виявлено жодного варіанту з імовірним функціональним ефектом. Двоє близьких родичів іншої особи померли під час сну в молодому віці без відомих причин. У цієї особи виявлено два варіанти з імовірними функціональними ефектами (Таблиця 3, ID 7).

Стіл в натуральну величину

У нашому дослідженні 16 (26%) випадків SUD мали психічні захворювання відповідно до наявних медичних карток. Сім (13%) та вісім (15%) застосовували антипсихотичні засоби відповідно. Антидепресанти. Згідно з наявними SPC, антипсихотики та антидепресанти, що застосовувались у померлого, мали дуже низьку або невідому частоту подовження інтервалу Q. C. Крім того, у 14 (23%) випадків SUD була епілепсія, а в 10 (19%) - один або кілька протиепілептичних препаратів у крові (табл. 2). Жоден з препаратів, що застосовуються для лікування епілепсії, не мав відомої частоти подовження інтервалу QT згідно з наявними SPC.

Варіанти з імовірним та невідомим функціональним ефектом

Загалом у 21 (34%) осіб було 25 генетичних варіантів, які були класифіковані як такі, що можуть мати функціональні ефекти (табл. 3). Десять із цих варіантів були новими. Середній вік пацієнтів з імовірними функціональними ефектами становив 36 років (діапазон 1–49) і включав 11 чоловіків (52%). З варіантів з імовірним функціональним ефектом було 22 мутації місенсу та 3 мутації безглуздя (табл. 3). Десять (40%) та 15 (60%) варіантів були знайдені в генах, раніше виявлених пов’язаними з кардіоміопатіями або серцевими каналопатіями. У семи осіб, які мали варіанти з імовірними функціональними ефектами, також були варіанти невідомого функціонального ефекту. Крім того, 19 особин мають лише генетичні варіанти з невідомим функціональним ефектом (дані про невідомі варіанти наведені в додатковій таблиці S2). Решта 21 (34%) випробовуваних не мали жодного варіанту з імовірним або невідомим функціональним ефектом.

Фізична активність на момент смерті

Шість (10%) випадків SUD померли під час фізичних навантажень. Чотири з них мали варіанти з імовірним функціональним ефектом. 39-річна жінка впала під час ходьби і мала варіант із імовірним функціональним ефектом у KCNJ8 (c.1066C> T, p. (R356 *)). У неї раніше не було повідомлень про симптоми серцевих захворювань. Дві особи загинули під час занурення: 46-річна жінка, у якої був один варіант із ймовірним функціональним ефектом у MYBPC3 (c.442G> A, p. (G148R)), а інша у TNNC1 (c.433G> A, p ( D145N)) та 35-річного чоловіка з варіантом, який, ймовірно, матиме функціональний ефект у MYBPC3 (c.3742G> A, p. (G1248R)). Два дайвери не повідомили про будь-які попередні симптоми, що вказували на серцеві захворювання. Під час футбольної пробіжки 15-річний чоловік раптово впав. У нього був один варіант із ймовірним функціональним ефектом у CACNB2 (c.641G> C, p. (S214T)), а інший - у MYBPC3 (c.649A> G, p. (S217G)). Раніше під час футболу у нього було два випадки непритомності, і коли він помер, його обстежили на наявність серцевих захворювань. На ЕКГ показана шлуночкова екстрасистолія, але діагноз не встановлений.

обговорення

Ми здійснили секвенування 100 генів, пов’язаних із захворюваннями серця, у 61 датському випадку SUD із використанням NGS. Один або кілька варіантів з імовірним функціональним ефектом були виявлені у 21 (34%) осіб. З 21 особини 12 мали варіанти з можливими функціональними ефектами виключно у генах, раніше пов’язаних із серцево-іонною хворобою. Шість осіб мали варіанти з ймовірними функціональними ефектами виключно у генах, раніше асоційованих із кардіоміопатичними захворюваннями. Три особи мали варіанти з ймовірними функціональними ефектами в генах, асоційованих з канюлопатією та кардіоміопатією.

Частота варіантів генів, пов'язаних з кардіоміопатією, була вищою, ніж очікувалося. Кардіоміопатії часто змінюються за вираженням і з неповним проникненням, а початкові фенотипічні зміни можуть бути не видно при розтині або можуть вважатися неспецифічними або в межах норми. Як повідомляється, варіанти, пов’язані з кардіоміопатіями та структурними змінами в серці, можуть призвести до аритмій, а в деяких випадках опосередкованих порушеннями серцевої діяльності. Це підтверджується функціональними дослідженнями десмосомних генів, для яких раніше було доведено, що вони асоційовані з ARVC. 3, 4, 5, 6 Вперше було показано, що ген PKP2 асоціюється з ARVC, коли Gerull та співавт. 24 виявили, що у 32 пацієнтів з ARVC існувало 25 варіантів PKP2. Варіанти ПКП2 були знайдені в

70% усіх випадків ARVC. 4, 25 Нещодавно було встановлено, що PKP2 асоціюється з BrS без структурних серцевих аномалій. 3, 4 Cerrone et al 3 виявили варіанти PKP2 у 2,5% досліджених пацієнтів із BrS. Тому в цьому дослідженні було висловлено припущення, що PKP2 відіграватиме роль у перенесенні натрієвих каналів на інтеркальований диск за допомогою невідомого механізму. 3 Чжан та ін. 4 виявили однакову кількість варіантів PKP2 у пацієнтів з ARVC та SUD з негативною аутопсією та дійшли висновку, що раптова смерть може бути наслідком аритмії через зменшену локалізацію білків каналу Nav1,5 на інтеркальований диск, збільшуючи тим самим відстань між плюсовим кінцем мікротрубочок та центральна бляшка N-кадгерину. Було виявлено, що варіанти DSP та DSG2, які також є частиною серцевого десмосомного комплексу, пов'язані з дисфункцією Nav1.5 у мишей та клітинах HL-1. 5, 6 мутації саркомерних генів були також у випадках синдрому раптової дитячої смерті (SIDS), при яких не спостерігалося структурних змін. Brion et al. 26 знайшли більше описаних раніше варіантів генів саркомерів у 286 жертв СІДС. Вони припустили, що варіанти генів саркомерів можуть бути причиною смерті у цих дітей, навіть якщо у дітей не було структурних змін у серці.

У цьому дослідженні ми виявили, що дві третини (40 осіб) випадків SUD мали варіанти з невідомими функціональними ефектами або відсутні варіанти з імовірними або невідомими функціональними ефектами. Причина смерті цих осіб досі залишається без відповіді та викликає нові питання; Чи існують інші гени або регуляторні елементи (метилювання, мікроРНК та ін.), Які виявляються лише у випадках SUD і ніколи не присутні у осіб, що живуть із захворюваннями серця? Було б цікаво продовжити розслідування цих випадків шляхом послідовного розподілу всього геному та вивчення епігенетичних факторів.

Фізична активність на момент смерті

Шість (10%) випадків SUD померли під час фізичних навантажень, включаючи ходьбу, дайвінг, їзду на велосипеді чи футбол. Чотири з цих шести осіб мали варіанти з ймовірними функціональними ефектами, три з яких були у MYBPC3. У 46-річного дайвера раніше спостерігався варіант MYBPC3 (c.442G> A) у пацієнта з HCM. У 35-річного дайвера-чоловіка раніше спостерігали варіант MYBPC3 (c.3742G> A) у іншого пацієнта з HCM 28 і класифікували його як патогенний. У дослідженні 15-річного футболіста були варіанти MYBPC3 (c.649A> G), де цей варіант був виявлений у двох випадках SIDS та описаний як потенційно патогенний. В іншому дослідженні цей варіант був виявлений у 19-річної жінки, у якої після запуску зупинка серця була згодом діагностована HCM. Крім того, варіант був описаний тим самим дослідженням, що і в попередньому тексті Андреасен та співавт., 29, який виявив, що цей варіант має низьку частоту і, можливо, патогенний. Усі троє осіб з варіантами MYBPC3 з імовірним функціональним ефектом виконували легкі та важкі фізичні вправи на момент смерті.

Раптова несподівана смерть від психічних захворювань та епілепсії

У цій групі SUD 16 (26%) випадків SUD мали психічні захворювання відповідно до наявних медичних карт (табл. 2). У п’яти (31%) осіб із психічними захворюваннями було виявлено один або кілька варіантів з імовірним функціональним ефектом. Варіанти виявлено в генах SCN5A, KCNQ1, TTN та LMNA. Поширеність SUD у депресивних молодих людей не вивчалася широко. Відомо, що середня тривалість життя в Данії для хворих на шизофренію на 16-20 років коротша, ніж для загальної популяції. В недавньому дослідженні з Австралії, Sweeting et al. 32 виявили, що найпоширенішою причиною смерті у хворих на шизофренію були серцево-судинні захворювання (23%) і що 11% смертей були незрозумілими після розтину.

Першопричини ССД та СУЗ при психічних розладах не встановлені, але припускається, що аритмії, викликані наркотиками, мають велике значення при депресії 33 та шизофренії. 34, 35, 36, 37

Це дослідження має деякі обмеження. Перш за все, це дуже відібрана когорта, яка потенційно знижує узагальненість наших висновків. Потрібно проводити функціональні дослідження та аналіз сегрегації в сім'ях для подальшого вивчення варіантів з імовірними функціональними ефектами. Генетичні висновки цього дослідження самі по собі не можуть визначити причину смерті, оскільки багато з виявлених варіантів є новими і потребують подальшого дослідження.

Підводячи підсумок, ми виявили, що одна третина загиблих осіб з негативною судово-медичною розтиною мала один або кілька варіантів із ймовірним функціональним ефектом у генах, асоційованих із кардіоміопатіями та серцевими каналопатіями. Крім того, було виявлено, що 19 та 21 особа мають лише варіанти невідомої значущості або відсутність варіантів значимості. Отримані нами дані свідчать про те, що широкий генетичний скринінг із використанням NGS є корисною діагностичною частиною судово-медичного розслідування у випадках SUD, коли неможливо визначити причину смерті після планового розтину. Оскільки значна кількість варіантів з імовірним функціональним ефектом була виявлена ​​в генах, які, як було встановлено, пов’язані з кардіоміопатіями, ми припускаємо, що генетичне тестування жертв SUD включає гени, що беруть участь як у структурних, так і в неструктурних захворюваннях серця. Крім того, дві третини осіб, у яких не було виявлено жодного варіанту з ймовірним функціональним ефектом, змушують нас замислитися, чи існують інші гени або регуляторні елементи, які ще не з’явились у цих незрозумілих смертях.