предметів

реферат

Альдостерон - це мінералокортикоїдний гормон, що виробляється в корі надниркових залоз. У фізіологічних умовах зв’язування альдостерону зі специфічними внутрішньоклітинними мінералокортикоїдними рецепторами (МР) у дистальному нефроні регулює гомеостаз електролітів та води. Таким чином, альдостерон регулює об’єм крові та артеріальний тиск. Однак альдостерон також сприяє розвитку пошкодження нирок, про що повідомлялося в ряді досліджень. Первинний альдостеронізм, що характеризується високим рівнем альдостерону в плазмі та низькою активністю реніну, часто корелює з підвищеним ризиком ураження нирок. 5

Мишей Cry1,2 DKO використовували для дослідження пошкодження нирок, спричиненого альдостероном, за відсутності попередніх ниркових маніпуляцій, лікування високою кількістю солі та/або введення мінералокортикоїдів. Відомо, що криптохром регулює циркадні ритми. 14 мишей Cry1, 2 DKO демонструють підвищену експресію мРНК та рівень білка 3β гідроксистероїддегідрогенази, ферменту, який бере участь у синтезі альдостерону. Фермент в основному експресується в зоні гломерулози, де, як відомо, відбувається виключно вироблення альдостерону. Таким чином, миші Cry1,2 DKO демонструють високий рівень альдостерону, але низьку плазмову активність. 15

методи

Експерименти на тваринах

У цьому дослідженні ми використовували криптохромно-нульових мишей (Cry1, 2 DKO), які характеризуються високим рівнем альдостерону в плазмі та пригніченням активності реніну. Розвиток мишей Cry1,2 DKO було описано вище. Під час дослідження всі миші підтримували стабільну температуру навколишнього середовища з 12-годинним циклом світло-темрява і мали вільний доступ до води та їжі. Всі експериментальні протоколи проводились на основі експериментів на тваринах в Університеті Кобе, Японія.

В якості контролю ми використовували мишей Cry 1, 2 DKO та стандартних (WT) братів та сестер. Ми розділили 12-тижневих самців мишей на наступні шість груп: мишей WT, які отримували нормальну обробку солями (WTNS; n = 17), мишей WT, які отримували високу кількість солі (WTHS; n = 16), мишей Cry1, 2 DKO, які отримували нормальну обробка солі (CRYNS; n = 13), миші Cry1, 2 DKO, які отримують високу кількість солі (CRYHS; n = 20), миші Cry1, 2 DKO, які отримують обробку високою кількістю солі та спіронолактону (CRYSPI; n = 13); ) та Cry1, 2 миші DKO, які отримували високу кількість солі та гідралазину (CRYHYD; n = 6). Всім мишам проводили відповідне лікування протягом 32 тижнів. Звичайна сольова дієта мала вміст NaCl 0,2%, тоді як дієта з високим вмістом солі містила 3,15% NaCl, а питна вода - 1% NaCl і 0,2% KCl. Спіронолактон або гідралазин вводили у питну воду. Дози спіронолактону (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) та гідралазину (Sigma-Aldrich) становили 6 мг кг-1 маси тіла на добу та 25 мг кг-1 маси тіла на день. Спіронолактон розчиняють у етанолі, а потім розводять у питній воді.

Вимірювання артеріального тиску

Артеріальний тиск визначали у свідомих дресированих мишей за допомогою неінвазивної автоматизованої комп’ютерної автоматизованої системи хвостових манжет (BP-98A, Softron, Токіо, Японія). Для аналізу даних використовували середнє значення 10 вимірювань.

Біохімічний аналіз крові та сечі

Після 32 тижнів лікування отримували кров для біохімічного аналізу шляхом серцевої пункції перед тим, як мишей забивали. Збір 24-гурину проводили за допомогою метаболічних клітин за 1 день до загибелі мишей. Концентрацію креатиніну в сироватці та сечі вимірювали за допомогою ферментативного аналізу (Nescoat VLII CRE Kit; Alfresa Pharma Corp, Осака, Японія). Комерційно доступний набір імуноферментних аналізів використовували для вимірювання альбуміну в сечі (Bethyl Laboratories, Монтгомері, Техас, США) відповідно до інструкцій виробника. Альдостерон у сироватці крові вимірювали за допомогою комерційно доступного набору імуноферментних аналізів (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA, USA) відповідно до протоколу, описаного виробником. Електроліти сироватки та сечі вимірювали за допомогою іонно-селективного електрода та обчислювали за допомогою рівняння Нернста.

Експресія гена

Загальну РНК з видаленої нирки екстрагували за допомогою RNAIsoPlus (TaKaRa, Далянь, Китай). Зворотну транскрипцію проводили за допомогою ReverTra Ace (Тойобо, Осака, Японія) згідно з інструкціями виробника. Кількісне визначення рівнів експресії реніну, MR, 11β гідроксистероїддегідрогенази типу 2 (11BHSD2), нефрину та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (G6PD) проводили за допомогою суміші Thunderbird SYBR qPCR (Тойобо, Осака, Японія) відповідно до описаного протоколу. виробник. Праймери, використані в цьому дослідженні, були наступними: ренін (вперед: 5'-ATGAAGGGGGTGTCTGTGGGGTC-3 '; зворотний: 5'-ATGTCGGGGAGGGTGGGCACCTG-3 ′), MR (вперед: 5′-GGAAACCAAAGGCTACCACA-3 ′ GG 11BHSD2 (вперед: 5′-TTTGGTGCACTTGAGCTGAC-3 ′; реверс: 5′-GGTATGGCATGTCTCCTGCT-3 ′), нефрин (вперед: 5′-ACTACGCCCTCTTCAAATGCA-3 ′; реверс: 5′-TCCACG '(5′-TCCACG) GTTAAATGGGCCAGCGAAG-3 ′; реверс: 5′-CCTGCTCTGCCATGATGTTT-3 ′) і гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа (вперед: 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ TGGA: 5′TGGGG TC: 5′TGGGG ′;.

Кількісна оцінка гістопатології

Оцінка продуктивності активних форм кисню

Оцінку активних форм кисню (АФК) проводили на кріосекціях, забарвлених дигідроетидієм. Коротко, кріосекції інкубували з 5 мкМ дигідроетидієм у диметилсульфоксиді при 37 ° С протягом 30 хвилин. Кількісне визначення інтенсивності дигідроетидію проводили з використанням 15 полів зору при 200-кратному збільшенні.

Статистичний аналіз

Всі дані представлені як середнє значення ± sem Ми припустили, що групи зазвичай не розподілялись. Таким чином, ми провели статистичний аналіз кількох груп, використовуючи непараметричний тест Крускала-Уолліса, а потім U-тест Манна-Уітні між цими двома групами. Значення Р19 також вимірювали експресією 11BHSD2 у цілій нирці. Однак ми не спостерігали різниці у вираженні 11BHSD2 між різними групами (рисунки 1c та d).

хронічний

Концентрація альдостерону в сироватці крові ( a ) і ренін ( b ), мінералокортикоїдний рецептор (MR) ( c ) та експресія мРНК 11pHSD2 (11BHSD2) ( d ). Рівні альдостерону в сироватці крові вимірювали у п’яти-дев’яти мишей. ( b - d ) Графіки представляють співвідношення між експресією мРНК та експресією мРНК гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) у цілій нирці (n = 4). Дані представлені як середнє значення ± sem * P

Систолічний артеріальний тиск, виміряний у мишей, які перебувають у свідомості, за допомогою методу хвостової манжети. Дані представлені як середнє значення ± sem n = 6–14. * P

Кліренс креатиніну ( a ), альбумінурія ( b ), калій у сироватці крові c ), сироватка натрію d ), рівень калію в сечі e ) та рівень натрію в сечі ( f ) миші після 32 тижнів лікування. Дані представлені як середнє значення ± sem n = 6–13. * P

Репрезентативні зображення періодичного фарбування кислотою-Шиффом (PAS) трубчастої області, фарбування Sirius червоним кольором трубчастої області та GAS фарбування області клубочкової PAS ( a ). Графіки представляють кількісну оцінку оцінки пошкодження труб ( b ), гломерулосклероз c ) та канальцевий інтерстиціальний фіброз ( d ). Пошкодження труб було виявлено за допомогою фарбування PAS ділянки канальців як вакуолізація труб (стрілка) та втрата краю щітки (стрілка стрілки). Дані представлені як середнє значення ± sem n = 6–14. * P

Вираз нефрину. a ) Репрезентативне зображення імунофлуоресцентного фарбування нефрином та b ) кількісна оцінка сигналу у відсотках до площі клубочків (n = 5–10). ( c ) Графіки представляють співвідношення між експресією мРНК та експресією мРНК GAPDH (n = 5-7). Дані представлені як середнє значення ± sem * P

Фарбування дигідроетидієм (DHE) ( a ), кількісне визначення фарбування DHE b ) та експресія мРНК глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (G6PD) ( c ). Кількісне визначення фарбування DHE проводили за п’ятьма зразками в кожній групі. ( a ) DHE-позитивне фарбування показує червоне флуоресцентне фарбування на клітинному ядрі в клубочкових (G) та канальцевих (T) областях. ( b ) Кількісна оцінка інтенсивності фарбування DHE. ( c ) Графіки представляють співвідношення між експресією мРНК G6PD та експресією мРНК GAPDH (n = 6-11). Дані представлені як середнє значення ± sem * P 20, 21, 22 Тому гіпертонія не повинна використовуватися як передумова для первинної діагностики альдостеронізму. Також передбачається, що нормокаліємія не повинна виключати можливість первинного гіперальдостеронізму. 23

Ми зазначили, що у мишей Cry1, 2 DKO у цьому дослідженні розвинулася альбумінурія після нормальної обробки солями та за відсутності підвищеного артеріального тиску. Альдостерон здійснює свій ефект, зв'язуючись з МР. МР експресується в нирках переважно в дистальних канальцях і в збірних протоках. Повідомляється про зниження експресії МР у клубочках, особливо у мезангіальних клітинах 25 та подоцитах 26, в яких альдостерон може діяти безпосередньо. У односторонніх нефректомізованих щурів, яким застосовували альдостерон та застосовували високу кількість солі, виявлено, що протеїнурія пов’язана зі зниженням рівня нефрину, асоційованого з подоцитами білка. 26 Нефрин експресується спеціально в мембранній мембрані подоцитів і тому відіграє важливу роль у функції бар'єру клубочкової фільтрації. У цьому дослідженні ми спостерігали, що миші Cry1, 2 DKO демонстрували знижений рівень експресії нефрину. Отже, ми припускаємо, що зменшення експресії нефрину у мишей Cry1,2 DKO призводить до порушення клубочкового фільтраційного бар’єру і, отже, принаймні частково впливає на рівень альбуміну в сечі.

Порівняно з моделями на тваринах, що поєднують односторонню нефректомію з високим вмістом солі та мінералокортикоїдів, де відносно короткочасне лікування (4-8 тижнів) спричиняло серйозні ураження нирок, включаючи гломерулосклероз та нирковий фіброз, 8, 12 пошкодження нирок, що спостерігаються у нормальної солі. оброблені мишами Cry1, 2 DKO протягом 32 тижнів були менш важкими. Крім того, навіть після 32 тижнів лікування високою кількістю солі у мишей Cry1, 2 DKO не розвивався гломерулосклероз або інтерстиціальний фіброз. Виходячи з цих спостережень, ми не можемо виключити, що хронічний ендогенний гіперальдостеронізм може індукувати адаптаційні механізми, які можуть обмежити шкідливі ефекти альдостерону. Ці результати можуть відображати клінічні висновки у пацієнтів з первинним альдостеронізмом, у яких часто спостерігається мікроальбумінурія та підвищена швидкість клубочкової фільтрації 31, що може бути успішно вилікувано за допомогою адреналектомії або терапії блокатором МР. 32, 33, 34 Крім того, вважається, що важке ураження нирок розвивається через кілька років. 35

З огляду на роль криптохромів у циркадному ритмі, ефект делеції криптохрому у мишей Cry1,2 DKO не можна ігнорувати. Підвищення рівня альбуміну в сечі, зниження експресії нефрину та збільшення продукування АФК у мишей CRYHS, оброблених високою кількістю солі, пригнічувалося лікуванням спіронолактоном. Таким чином, ми припустили, що пошкодження нирок у мишей Cry1, 2 DKO асоціюється з гіперальдостеронізмом.

Нарешті, рівні експресії нефрину та вироблення АФК у мишей у групі, яка отримувала спіронолактон, були кращими, ніж у групі CRYNS, і порівнянними з такими у групі WTNS. На додаток до пригнічення комбінованого ефекту гіперальдостеронізму та солі, спіронолактон може також пригнічувати ефект лише гіперальдостеронізму.

На закінчення наше дослідження показало, що шкідливий вплив альдостерону на нирки може бути незалежним від впливу високих солей і високого кров'яного тиску, але лікування з високим вмістом солі погіршує ці ефекти. На основі наших висновків ми припускаємо, що контролю артеріального тиску може бути недостатньо для захисту нирок при первинному альдостеронізмі; однак у таких випадках достатнього блокування альдостерону може бути достатньо для захисту нирок.