кістки

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Скринінг ZooMS на залишки гомініну
  • Мікро КТ DC1227
  • Радіовуглецевий аналіз DC1227
  • Послідовності мітохондріальної ДНК (mtDNA) із зразка DC1227
  • висновки
  • методи
  • збільшувати
  • комп'ютерна томографія
  • Мітохондріальний аналіз ДНК
  • Вилучення ДНК та підготовка бібліотеки
  • Мітохондріальний захоплення та секвенування
  • Обробка та відображення послідовностей
  • Філогенетичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Файли Excel
  • Додаткова інформація 1
  • Коментарі

предметів

  • археологія
  • Мас-спектрометрія

реферат

Секвенування ДНК революціонізувало наше розуміння архаїчних людей у ​​середньому та верхньому палеоліті. На жаль, хоча багато палеолітичних місць містять велику кількість кісток, більшість із них не мають діагностичних елементів, необхідних для традиційної морфологічної ідентифікації. Як результат, регенерація решток плейстоцену людини відбувається дуже рідко. Щоб вирішити цю проблему, ми використали метод видалення колагену з більш ніж 2000 фрагментованих кісток з печери Денисової печери в Росії, щоб полегшити виявлення людських останків. Результатом нашого аналізу стала ідентифікація однієї кістки гомініну (Денисова 11), підкріплена поглибленим аналізом пептидів і виявила, що містить мітохондріальну ДНК неандертальського типу. Подальші знайомства з вуглецем показали, що кістці було більше 50 000 років. Тут ми демонструємо величезний потенційний відбиток колагену для виявлення залишків гомініну у сильно фрагментованих археологічних збірках, таким чином покращуючи ресурси, доступні для більш широких досліджень людського розвитку.

Отже, скам'янілості гомінінів з печери Дениса виявились дуже цінними для нашого розуміння архаїчних популяцій гомінінів. Це підкреслюється винятковим станом збереження древніх молекул ДНК в деяких кістках, придбаних на місці. Наприклад, фанікс Денисова (Денисова 3) містив> 70% ендогенної ДНК, яка забезпечувала геном з високим охопленням (30x) 7. Однак, незважаючи на інтенсивні розкопки в печері Дениса, серед тисяч викопаних кісток було виявлено лише кілька залишків гомінінів. Виявляються або зуби, або невеликі розміри, як правило, фаланги, у яких рідше розвивається фрагментація, що призводить до втрати діагностичних ознак. Така фрагментація, яка спричинена тафономією навколишнього середовища та м’ясоїдною чи людською діяльністю, призводить до високого відсотка відновлення кісток від цієї та багатьох інших археологічних пам’яток, які неможливо ідентифікувати за їх морфологією 3, 8. Тільки в Східній галереї печери Дениса під час розкопок між 2005 і 2013 роками було отримано приблизно 135 600 кісток; 128 591, однак, не вдалося ідентифікувати 8 .

Тут ми застосовуємо метод ідентифікації видів шляхом масового сканування пептиду колагену, відомого як Зооархеологія за допомогою мас-спектрометрії (ZooMS), до 2315 архівованих неідентифікованих фрагментів кісток з печери Дениса. Ці недіагностичні кістки були відібрані з матеріалу, витягнутого зі Східної галереї печери в 2014 році. Залишки варіювали за розміром, як правило, від 3 до 5 см, з кістками, які були досить великими, щоб бути корисними для подальшого аналізу (тобто вуглець і аналіз ДНК), бажано обраний. У недалекому минулому аналіз ZooMS успішно розрізнив різні групи ссавців, включаючи одомашнених таксонів 9, 10, диких наземних таксонів 11, 12 і морської фауни 13, а також деяких таксонів не ссавців 13, 14. Для досягнення це ZooMS використовує для аналізу домінуючого білка в кістці, пептидного відбитка пальця, колагену типу 1 (COL1), який відомий своєю довговічністю, особливо в холодному кліматі. Цей метод давав відбитки пальців колагену у зразках від

результат

Скринінг ZooMS на залишки гомініну

Опубліковані до цього часу маркери людини позначаються A-G. Всі пронумеровані піки представляють підтверджені пептиди, що відповідають послідовності, що спостерігаються в людському колагені (крім Е, який відомий лише подібністю до гомологічних маркерів у інших видів 9).

Повнорозмірне зображення

Зразок, який був ідентифікований як гомінін DC1227, був вийнятий з площі А-2, шар 12 Східної галереї. До відбору проб кістка важила 1,68 г, максимальна довжина - 24,7 мм, ширина - 8,39 мм. Для аналізу ZooMS було зібрано приблизно 36 мг (рис. 2). Кістка видається досить мізерною, без будь-яких морфологічних ознак або доказів модифікації цілі, тому її легко пропустити під час остеологічного аналізу.

Повнорозмірне зображення

Мікро КТ DC1227

Мікрокомп’ютерну томографію (мікро-КТ) проводили перед подальшим руйнівним відбором проб для аналізу вуглецю та мітохондріальної ДНК. Через рідкісність цих знахідок мікро-КТ вважали придатним для ідентифікації ділянок, на які вплинула видима деградація, і тому їх слід уникати в майбутньому аналізі. Результати показали, що зразок був дуже щільним і без серії діагенетичних мікротріщин, що пройшли через його довжину, без ознак деградації кісток. Три з цих мікрометричних тріщин проходять в безпосередній близькості одна від одної через кістку, але не утворюють тріщин і, здається, не порушують кісткову структуру. Сканування також підкреслило ступінь травлення та ямок на кістковій поверхні, що може бути наслідком проходження через травну систему м’ясоїдних тварин (рис. 3). Ряд хижаків відведено на місці; Через появу гієн у Денисовій печері представляється ймовірним, що кістка травилась кислотою через шлункові кислоти гієни 8, .

Повнорозмірне зображення

Радіовуглецевий аналіз DC1227

Радіовуглецеве датування проводили в Оксфордському підрозділі прискорення радіовуглецю (ORAU) згідно зі стандартними процедурами та протоколами 23, із віком, що оцінюється> 49900 років до н. . кістковий колаген. Результат повністю відповідає передбачуваному геоархеологічному віку щодо стратиграфічної послідовності на місці.

Ізотопні вимірювання вуглецю та азоту дали значення 813C -17,3 ‰ та значення A515N 16,4 ‰. Гомініни в цьому регіоні зазвичай повертають значення ізотопу азоту між 13 - 15 ‰, зазначеними, наприклад, між неандертальцями в печері Окладникова 24. Підвищений рівень DC1227 може свідчити про різні дієтичні аномалії, включаючи багату білками дієту, отриману з організмів з більш високим рівнем трофіки, таких як прісноводна риба 25, 26. Для того, щоб поставити підвищені значення ізотопів у потрібний контекст, необхідні подальші дослідження, які будуть обговорені в майбутньому. Такі дослідження ізотопного складу гомініну та суміжної фауни з Денисової можуть виявити важливу інформацію про раціон палеолітичних гомінінів, що мешкають на Алтаї, і такі дослідження в даний час проводяться в Оксфордському університеті.

Послідовності мітохондріальної ДНК (mtDNA) із зразка DC1227

Ми витягли ДНК з 30,9 мг кісткового порошку з DC1227 27. Аликвотна частина екстракту була перенесена в одноланцюгову бібліотеку ДНК 28, яку збагатили для фрагментів мітохондріальної ДНК гомініну за допомогою мітохондріальних зондів людини 29. Ізольовані фрагменти ДНК секвенували і наносили на оновлену референтну мітохондріальну еталонну послідовність людини (rCRS). Загалом ми ідентифікували 282 502 унікальних фрагменти мтДНК довжиною понад 35 пар основ (Додаткова таблиця S1).

Щоб оцінити, чи були деякі фрагменти мтДНК давнього походження, ми використали той факт, що основи цитозину (С) на кінцях молекул ДНК, як правило, піддаються дезамінуванню з часом, і тому зараховуються ДНК-полімеразою як тиміни (Т). Таким чином, древні фрагменти ДНК, вирівняні з контрольною послідовністю, як правило, несуть високі частоти очевидних заміщень С на Т на своїх 5'- і 3'-кінцях 31, 32, 33. З фрагментів, що починаються або закінчуються в положеннях, де основою rCRS є C, 32, 2% і 31, 3% несуть Ts на своїх 5 'і 3' кінцях (додаткова фігура S13), що свідчить про те, що в DC1227 присутні древні молекули ДНК гомініну.

Щоб визначити, чи є ендогенна мтДНК DC1227 найбільш безпосередньою з мітохондріальними геномами людини, неандертальця чи Денісова, ми обмежили аналіз послідовностями, що мають заміщення C на T, порівняно з rCRS на одному з їх кінців 34, щоб зменшити вплив передбачуваних даних. забруднення поточною ДНК людини (додаткова інформація). Використовуючи 36 665 таких послідовностей (Додаткова таблиця S1), мітохондріальний геном зразка DC1227 був реконструйований із середнім охопленням у 130 разів, при цьому 63 позиції залишились охопленими двома або менше послідовностями, а чотири, де менше двох третин послідовностей містили однакові база. Таким чином, 67 позицій не можна було назвати з упевненістю.

Порівнюючи DC1227 мтДНК з визначеною на сьогодні повною неандертальською мтДНК, вона дає п’ять основних відмінностей від неандертальської мтДНК Okladnikov 2 33, знайденої приблизно в 60 км від печери Дениса, від 12 до 17 відмінностей від неандертальців із Західної та Південної Європи та 31 різниця. з Кавказу 35 та неандертальця у печері Дениса 5. Для порівняння, мтДНК від DC1227 відрізняється між 174 і 354 основами від мтДНК інших груп гомінінів (Додаткова таблиця S2). Таким чином, під час філогенетичного аналізу (рис. 4) мітохондріальний геном DC1227 потрапляє у варіацію з десяти неандертальців, виключаючи 311 сучасних людей, десять стародавніх сучасних людей, двох денісанів та гомінін середнього плейстоцену з Іспанії. Ми прийшли до висновку, що особина DC1227 несе мітохондріальний геном типу неандертальця, і зараз її називають Денисовою 11.

МтДНК шимпанзе (не показано) була використана як вихідна група. Підтримка кожної гілки базується на 500 реплікаціях початкового завантаження. Географічне походження давніх зразків наведено в таблиці S2.

Повнорозмірне зображення

висновки

методи

збільшувати

Від кожної кістки в групі брали від 20 до 50 мг кістки і демінералізували в 0,6 М соляній кислоті (HCl) протягом 18 годин. Отриманий залишок видаляли до ультрафільтра з відсіканням молекулярної маси 30 кДа (MWCO) і центрифугували при 3700 об/хв протягом 1 години. Потім фільтрат двічі промивали 500 мкл 50 мМ бікарбонату амонію (AmBic) і далі центрифугували при 3700 об/хв. Протягом півгодини після кожного лікування. Кінцевий залишок ресуспендували додатково AmBic (200 мкл), половину якого видаляли для формування резервної проби перед перетравленням. Потім решту 100 мкл обробляли 0,2 мкг трипсину (етап послідовності; Promega UK) та інкубували при 37 ° C протягом 18 годин. Потім отриманий розчин змішували з матричним розчином 1 мкл розчину α-ціано-4-гідроксикоричної кислоти (10 мг/мл у 50% ацетонітрилі (ACN)/0,1% трифтороцтової кислоти (TFA)) і давали можливість кокристалізуватися. та аналізували за допомогою мас-спектрометра Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Bremen) MALDI Tof/Tof. Отримані мас-спектри перевіряли на маркери людини 9, 12 у програмному забезпеченні FlexAnalysis.

комп'ютерна томографія

КТ проводили за допомогою мікросканера Nikon XT H 225 з передавальною мішенню. Були зроблені спроби зберегти дозу якомога нижче, щоб уникнути пошкодження зразка, щоб сканування проводили при 70 кВ та 80 мкА. Всього було реалізовано 1448 проектів у двох зображеннях за проекцію, з експозицією, встановленою на 100 мс, і збільшенням × 7, 2. Дані були реконструйовані за допомогою програмного забезпечення CT Pro 3D та оброблені за допомогою програмного забезпечення VG Studio Max 2.1.

Мітохондріальний аналіз ДНК

Вилучення ДНК та підготовка бібліотеки

З DC1227 за допомогою стоматологічної бормашини видалено 30,9 мг кісткового порошку. ДНК витягували за допомогою протоколу на основі діоксиду кремнію для отримання коротких молекул ДНК 27, 36. 10 мкл екстракту ДНК (E3128) перетворювали в одноланцюгову бібліотеку ДНК (A9301), як описано в 28, 36. Кількість молекул ДНК у бібліотеці оцінювали за допомогою цифрової краплинної ПЛР (BioRad QX 200), використовуючи 1 мкл як вхід для аналізу EvaGreen (BioRad) з праймерами IS7 та IS837. Бібліотека була кодована двома унікальними індексами 36, 38 і посилена ДНК-полімеразою AccuPrime Pfx (Life Technologies) 39. Продукти ампліфікації очищали за допомогою набору для очищення ПЛР MinElute (Qiagen); і визначено кількісно на фотоспектометрі NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Мітохондріальний захоплення та секвенування

Ампліфікована бібліотека (A9317) була збагачена протоколом гібридизації 29 для захоплення бісеру за допомогою 52-мірних зондів 40, сконструйованих в одній парній базовій плитці на rCRS (посилання NC_012920 Національного центру біотехнологічної інформації [NCBI]) у два раунди захоплення, використовуючи 1 мкг відповідно 0,5 мкг вхідної ДНК. Захоплену бібліотеку (L5502) секвенували на платформі MiSeq (Illumina) із використанням парних кінців (2 х 76 циклів) із конфігурацією подвійного індексу 38. Протягом усієї процедури в якості негативних контролів проводили один пробіг екстракції порожньої ДНК та один пробіг підготовки порожніх бібліотек.

Обробка та відображення послідовностей

Основний дзвінок був зроблений за допомогою дрохви (Illumina). Послідовності адаптера були усічені, а пряме та зворотне зчитування об'єднані в окремі послідовності 41. Послідовності, в яких не вистачало ідеальних збігів із очікуваними штрих-кодами, були відкинуті. Нанесення на еталонний геном проводили за допомогою BWA 42 з параметрами "-n 0, 01-02-1 16500" 7. Дублікати ПЛР видаляли шляхом злиття послідовностей з однаковими координатами початку та кінця вирівнювання за допомогою bam-rmdup (//github.com/udo-stenzel/biohazard). Послідовності довжиною понад 35 основ з якістю відображення вище 30 залишали для подальшого аналізу.

Філогенетичний аналіз

Для реконструкції мтДНК DC1227 використовували послідовності, що несуть кінцеві заміщення від C до T. Термінал Ts в першій або останній позиції кожної послідовності перетворювався в Ns, щоб зменшити ефект помилок послідовності, отриманих від пошкодження консенсусного виклику. База консенсусу визначалася, якщо позиція охоплювалася принаймні трьома послідовностями і якщо щонайменше 67% послідовностей, тобто більше двох третин перекриваються послідовностей, містили ідентичну базу 34 .

МтДНК порівнювали з мтДНК 311 нинішні люди 43, 10 старих сучасних людей 31, 44, 45, 46, 47 десять неандертальців 5, 33, 35, 48, 49, два денізовани 3, 4 та середній плейстоцен гомінін 34 та шимпанзе (Pan troglodytes, NC_001643) 50 від MAFFT 51. Кількість основних відмінностей між послідовностями та деревом, що з'єднує сусід з реплікаціями 500 завантажувального репліка 52 на основі цих відмінностей, було створено MEGA6 53 .

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Браун, С. та ін. Ідентифікація нової кістки гомініну з печери Дениса в Сибіру за допомогою аналізу відбитків пальців ДНК колагену та мітохондрій. Наук. Респ. 6, 23559; doi: 10, 1038/srep23559 (2016).

Код доступу: Мітохондріальна геномна послідовність зразка DC1227 (Денисова 11) зберігалася в GenBank (номер приєднання KU131206).

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Файли Excel

Додаткова інформація 1

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.