предметів
реферат
Складання та зберігання амілоїдного β-білка (Aβ) є основною подією на ранніх стадіях хвороби Альцгеймера (AD) та церебральної амілоїдної ангіопатії. Зростаюча кількість доказів припускає, що гангліозиди утворюють патологічну платформу для утворення Aβ-зв’язаного гангліозиду, що полегшує збирання розчинного Aβ; однак молекулярні механізми, що лежать в основі зв'язування Aβ з гангліозидами в мозку, залишаються незрозумілими через відсутність системи in vivo, яка могла б вирішити цю проблему. У комах, включаючи плодову муху Drosophila melanogaster, гангліозиди в природі відсутні на рівні, який можна виявити. Тут ми продемонстрували, що експресія гангліозидів індукується дрозофілою завдяки експресії трансгенів ферментів синтезу гангліозидів та доставці екзогенної сіалової кислоти, а також що індукція синтезу гангліозидів значно прискорює збір Aβ in vivo. Наші результати підтверджують гіпотезу про те, що гангліозиди відповідають за збірку Аβ in vivo, а також дають можливість розробити цінну модель для базових досліджень, а також терапевтичну стратегію для БА.
Під час дослідження гіпотези GAp зоною фокусування було специфічне для області осадження варіантних типів Aβ, які генетично успадковуються. Наприклад, мутація голландського типу (E22Q) викликає відкладення амілоїду переважно в стінці судин головного мозку 5, 6, припускаючи, що ця стінка, яка складається переважно з судинних клітин гладкої мускулатури, експресує унікальні гангліозиди, які сприятливо ініціюють агрегацію клітин Голландії. типу Ap. Щоб дослідити цю можливість, ми проаналізували гангліозиди в гладком'язових клітинах судин і виявили ексклюзивну експресію GM3 та, меншою мірою, GM2 7. Крім того, як і очікувалось, збірка голландського типу Aβ значно зросла у присутності GM3 7 .
Метою цього дослідження було подальше дослідження гіпотези GAp за допомогою моделі дрозофіли, в якій маніпулювали індукцією GM3 та Aß голландського типу. Тут ми продемонстрували, що збірки Aß голландського типу значно прискорились у мух, індукованих GM3.
результат
Трансгенна індукція GalT6 та SAT1 для виробництва LacCer
Гангліозиди є глікосфінголіпідами і еволюційно зберігаються у ссавців; однак більшість безхребетних, включаючи комах, не містять гангліозидів у своїх клітинах. На початковому етапі шляху синтезу гангліозидів ссавців GM3 генерується з глюкозилцераміду (GlcCer) через лактозилцерамід (LacCer) (рис. 1). Синтез GM3 (рис. 1) відповідає за 1,4-галактозилтрансферазу LacCer-синтазу ß1, 4-галактозилтрансферазу (GalT6/5) та α2,3-сіалілтрансферазу GM3-синтазу (SAT1, також відому як ST3GAL5 або GM3S).
Схема індукції гангліозидів. Шлях синтезу гангліозидів ссавців (ліворуч), ендогенний шлях дрозофіли (середина 8) та трансгенний шлях дрозофіли (праворуч у цьому дослідженні). У заповнених ящиках вказують донорів цукру або SA. У хребетних перший гангліозид, GM3, утворюється з глюкозилцераміду (GlcCer) через лактозилцерамід (LacCer). В ендогенному шляху дрозофіли GlcCer модифікується маннозилтрансферазою Egghead та GlcNAc трансферазою Brainiac. Ми індукували експресію GM3, використовуючи трансгенні (Tg) конструкції та годуючи донорських SA мух. Крім того, шлях синтезу CMP-SA частково зберігається у дрозофіли (див. Додатковий малюнок S2).
Повнорозмірне зображення
Оскільки GalT6/5 та SAT1 не були виявлені у дрозофіли, ми створили індукційну систему GM3 з трансгенними мухами, що несуть людські GalT6 та SAT1 (рис. 1). Ці трансгени експресували за допомогою паннейронального драйвера C155-Gal4, а загальні ліпіди витягували з дорослих літаючих голів. За допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (LC-MS) ми ідентифікували сигнали гексоза-гексоза-Cer (Hex-Hex-Cer) у мух, що експресують GalT6, але не у мух, що експресують GalT6 (додатковий малюнок S1). Оскільки ендогенний Man-Glc-Cer (MacCer) є швидко метаболізованим проміжним продуктом, а трансгенний GalT6 відповідає за біосинтез LacCer, ці сигнали можна віднести до генерації Gal-Glc-Cer (LacCer), припускаючи, що екзогенний GalT6 індукує LacCer у дрозофіли як вище 8 (рис. 2а, в).
LC-MS аналіз LacCer та GM3. Вилучені ліпіди з голів дрозофіли аналізували за допомогою LC-MS MRM. Передбачалося, що всі церамідні структури LacCer та GM3 були присутні на основі попереднього дослідження, яке показало, що найбільш поширені види керамідів у дрозофіли містять сфінгозин ( d14: 1 ) 17. Ліпіди з личинок ЦНС, що експресують трансгени ( a ) GalT6 і SAT1 або ( b ) GalT6, SAT1 та GNE. Ліпіди з голів дорослих мух ( c ) ко-експрес-трансгени для GalT6 і SAT1 або ( d ) коекспресують трансгени для GalT6 та SAT1 та подають Neu5Ac.
Повнорозмірне зображення
Експериментальна індукція GM3 у мух
Ми також виявили SAT1 у плодових мух з GalT6; Однак GM3 не синтезувався у цих мух (малюнки 2a, c та таблиця 1). Ми припустили, що метаболізм SA у комах може відрізнятися від метаболізму у ссавців 9. На підтвердження цієї ідеї попередні дослідження виявили, що донор SA цитозин-5'-монофосфат (CMP) -Neu5Ac не виявлений у плодових мух, хоча опублікована функціональна сіалілтрансфераза дрозофіла 10, 11, 12, 13. Ми вважали, що CMP-Neu5Ac може бути недоступним для модифікації гліколіпідів, і припустили, що це є причиною відсутності виробництва гангліозидів у плодових мух. Ми використовували генетичний та хімічний підходи для вирішення цієї проблеми.
Стіл в натуральну величину
Прискорення збірки Aβ in vivo у мух, індукованих GM3
Попередні дослідження показали, що GM3 демонструє сильну спорідненість до голландського типу Aβ, а взаємозв'язок між GM3 і голландським типом Aβ прискорює збірку Aβ 7,18 in vitro. Щоб підтвердити ці висновки, використовуючи нашу індукційну систему GM3, ми генерували трансгенних мух, які несли голландський тип Aβ40 або Aβ42 (далі Dut40 або Dut42). У пацієнтів із людьми та трансгенних мишей з мутантами голландського типу Aβ40 переважно міститься в амілоїдних відкладах 19. Ми використовували дикий тип Aβ42 (WT42) як контроль шляху виробництва Aβ, оскільки пацієнти зі спорадичним типом AD та білками-попередниками A-трансгенних мишей демонструють домінантні відкладення Aβ42, а дикий тип Aβ має значно слабшу спорідненість, ніж Dut40 до GM3. 18 .
Трансгенні GalT6, SAT1 та WT42 або Dut40 постійно експресувались у нервовій системі мухи, і GM3 індукувався у цих мух, годуючи Neu5Ac, як описано вище. Цілі екстракти плавників для дорослих поділяли на розчинні у TBS і нерозчинні фракції. Синтез GM3 прискорив збір Dut40 в їх мозку (рис. 3а, в). На відміну від цього, WT42 не прискорював складання за цих умов (рис. 3b, c). Годування Neu5Ac лише не збільшувало складання Dut40 у мух, що експресують не GalT6/SAT1 (рис. 3d), припускаючи, що Dut40 є більш схильним до накопичення в присутності GM3 in vivo і що GM3 не впливає на Aβ на цих рівнях. виробництво.
Окрім участі в патологічному процесі розвитку БА, гангліозиди також є фактором інших захворювань у людини, напр. Цукровий діабет 2 типу, глухота, пухлинна інвазія та хвороба Паркінсона (ПД) 22, 28, 29, 30. У пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу підвищений рівень GM3 спричиняє інактивацію рецептора інсуліну через порушення мембранних мікродоменів, що призводить до інсулінорезистентності 28. І навпаки, втрата GM3 спричиняє слухову дисфункцію, оскільки вона необхідна для підтримки належної структури кохлеарних клітин волосся 22. Показано, що знижена індукція GM3 пов'язана зі злоякісною трансформацією 29. Крім того, недавнє дослідження повідомило, що лікування in vitro гангліозидом призвело до прискореного накопичення α-синуклеїну, головного причинного фактора PD31. Таким чином, наша індукована система індукції GM3 у дрозофіли може сприяти нашому розумінню механізмів, що лежать в основі розвитку цих захворювань людини.
методи
Літати запас
Мух витримували на стандартному агаровому середовищі з кукурудзяною крупою та дріжджами при 25 ° C у 12-годинному циклі світло/темно. Лінія elav-GAL4 c155 (C155-Gal4) була отримана від Фонду запасів дрозофіли Блумінгтона (Університет Індіани). Штам w1118 служив диким типом. UAS-sec: У нашому попередньому дослідженні 32 було створено ß 1-42 дикого типу (UAS-WT42). UAS-GalT6, UAS-SAT1, UAS-GNE та UAS-sec: У цьому дослідженні (описаному нижче) були створені Api-40 E22Q (UAS-Dut40).
Побудова трансгенів
Конструкція трансгену Aβ була описана раніше 32. Коротко, Aβ-послідовність ампліфікували за допомогою ПЛР з кДНК клітин HeLa і зливали з сигнальним пептидом 33, 34 попередника проенкефаліну-A. Мутація Aβ голландського типу (підкреслена) була введена в клоновану послідовність Aβ за допомогою ПЛР-ампліфікації (Pfu ДНК-полімераза, Promega) у поєднанні з праймерами: 5 'GTGTTCTTTGCACAAGATGTGGGTTCAA 3' (вперед) і 5 'TTGAACCCACATCTTGTGCAAAGAACAACkACACAACkACAC 3AC (3)) '(пере) у вектор pUAST 35 із сайтами Bgl II.
Кодуючі послідовності людських GalT6, SAT1 та GNE ампліфікували з кДНК мозку людини (Takara), клонували у вектор pCR-Blunt II-TOPO (Life Technologies), а потім індивідуально субклонували в сайти EcoR I вектора pUAST. Були використані наступні праймери. Клонування GalT6: 5 'ATGTCTGTGCTCAGGCGGAT 3' (вперед) і 5 'CTTGCCACGACAGCCACTTC 3' (перевернутий); Клонування SAT1: 5 ′ CATTAGTATGCGGACGAAGG 3 ′ (вперед) і 5 ′ GCTCTCAGAGTTAGAGTTGC 3 ′ (перевернутий); Клонування GNE: 5 ′ CATGGAGAAGAATGGAAATAACCGA 3 ′ (вперед) і 5 ′ CTAGTAGATCCTGCGTGTTG 3 ′ (реверс). Кожен трансген вводили в жовті білі ембріони, а потім схрещували із штамом w 1118 .
Індукція GM3 та мас-спектрометрія
Дорослим мухам надавали вільний доступ до фільтрувального паперу, змоченого 10 мМ N-ацетилневраміновою кислотою (Neu5Ac, Sigma) у 150 мМ сахарозі через день протягом одного тижня. Ми спостерігали, що Neu5Ac захоплюють мухи, додаючи харчовий барвник до розчину Neu5Ac (дані не наведені). Екстракцію ліпідів проводили, як описано вище 36. Від мух видаляли від 200 до 1000 комплексів личиночних мозкових дисків і дорослих дорослих голів, кожну групу органів окремо об’єднували та гомогенізували в TBS (50 мМ Tris-HCl, рН 7, 6, 150 мМ NaCl), а потім гомогенати випаровується. за допомогою відцентрового концентратора (Tomy). Гранули суспендували в хлороформі: метанол 2: 1 (об/об) і центрифугували при 17800 x g при 20 ° C протягом 2 хвилин. Два екстракти розчинника об'єднували і сушили при 42 ° С під газом N 2.
Вестерн-ляпси
Дякую
Це дослідження було підтримане Фондом досліджень наук про довголіття (гранти No 25-19 для KY та 28-46 для LT) від Національного центру з геріатрії та геронтології Японії.
Електронний додатковий матеріал
Додаткова інформація
Коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.