експериментальною

  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Масштабована клітинна метаплазія розвивається в легенях хронічно інфікованих мишей MTB
  • Швидкість плоскоклітинної метаплазії контролюється генетично
  • Плоскоклітинні метаплази призводять до злоякісної трансформації
  • Фактори, схильні до плоскоклітинного раку, присутні при ураженні легень туберкульозом
  • обговорення
  • Конфлікт інтересів
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаток 1

реферат

Туберкульоз (туберкульоз) залишається однією з основних причин смерті від інфекційних захворювань і створює глобальну загрозу для здоров’я населення. Вірулентні мікобактерії туберкульозу (МТБ) щорічно спричиняють понад 2 мільйони смертей у всьому світі, приблизно одна третина людської популяції несе збудника у прихованій формі. Результати туберкульозної інфекції варіюються від первинно прогресуючого захворювання, яке зустрічається менш ніж у 10% інфікованих осіб, до прихованої інфекції, яка може призвести до реактивації захворювання через багато років після первинної інфекції або залишатись субклінічною протягом життя інфікованих осіб. Легеневий туберкульоз розвивається в ~ 85% клінічних випадків і є найбільш епідеміологічно значущою формою захворювання. Здатність збудника викликати деструктивну хворобу легенів у імунокомпетентних господарів дозволяє ефективно передавати його через дихальні шляхи в людській популяції. Розуміння ініційованого патогенами процесу в легенях є ключовим фактором для розшифровки його еволюційно успішної стратегії вірулентності та розробки ефективних заходів боротьби із захворюваннями. Однак характеристики уражень туберкульозу в легенях, що відрізняють їх від гранульом в інших органах, залишаються невідомими.

Співіснування туберкульозу легенів та карциноми було описано багатьма патологами ще з першого звіту Бейла в 1810 р. (Sakuraba et al., 2006; Tan and Coussens, 2007). З тих пір припускають, що туберкульоз легенів може співіснувати з різними гістологічними типами раку легенів. Наприклад, було задокументовано тісний зв’язок метастатичної плоскоклітинної карциноми легень із ураженнями з великими порожнинами туберкульозу (Oka and Chan, 2005). Дослідження Dacosta та Kinare в Індії повідомило, що ураження туберкульозу, як активне, так і лікувальне, виявлено в легенях 30-33% пацієнтів з бронхогенними пухлинами порівняно з 7% у загальній популяції (Dacosta and Kinare, 1991). Курасава також повідомив про більш високі показники співіснування туберкульозу легенів та раку легенів, що в основному було представлено SCC у цьому дослідженні (Kurasawa, 1998). Надмірно високий рівень смертності від раку легенів спостерігався у хворих на аутопсію та хворих на туберкульоз, що не палять, на розтинах (Sakurai et al., 1989). Клінічний діагноз супутнього туберкульозу та раку легенів є проблемою, і часто існує значна затримка в застосуванні адекватного лікування для обох станів, що пов'язано з поганим прогнозом (Gopalakrishnan et al., 1975; Ting et al., 1976 ).

Причинний зв’язок між раком легенів та туберкульозом легенів не ясний. З одного боку, хронічна запальна реакція, пов’язана із прихованою туберкульозною інфекцією, може служити причиною злоякісних утворень. Ця можливість опосередковано підтверджується спостереженнями т.зв. "Шрам-шрам" (Cagle et al., 1985). Ардіє висунув гіпотезу, що у багатьох випадках рубцювання легенів було спричинено спонтанним загоєнням після повторної туберкульозної інфекції, і, ініціюючи цикли запальних процесів та процесів відновлення тканин, було створено сприятливе середовище для пухлини (Ardies, 2003). З іншого боку, рак легенів може розвиватися автономно, а потім індукувати реактивацію прихованого туберкульозу, послаблюючи місцевий імунітет. Це також ймовірний сценарій, оскільки майже третина людської популяції приховано інфікована MTB. Отже, причинно-наслідковий зв’язок не можна вивести лише з клінічних кореляційних зв’язків. Тим часом ця відмінність має вирішальне значення для демонстрації конкретних молекулярних механізмів, що лежать в основі співіснування туберкульозу з раком та розробки раціональних профілактичних та терапевтичних заходів.

У цьому дослідженні ми представляємо експериментальні докази того, що хронічної туберкульозної інфекції в легенях достатньо, щоб спричинити багатоступеневу трансформацію клітин, пов’язаних із ураженнями легенів туберкульозом, через плоскоклітинну дисплазію до злоякісної ССС. Ми показали, що крім пошкоджуючих ДНК активних форм кисню та азоту, інфіковані МТБ макрофаги також виробляють найсильнішого члена родини епідегулінових факторів епідермального росту, який може служити паракринним фактором росту на початкових етапах туморогенезу. У нашій моделі ми також виявили потужний генетичний модифікатор MTB-індукованого туморогенезу легенів: генетичний локус sst1 (Kramnik et al., 2000), який конкретно контролює пошкодження тканин і прогресування туберкульозу в легенях.

результат

Масштабована клітинна метаплазія розвивається в легенях хронічно інфікованих мишей MTB

Початкові скупчення SCC-подібних клітин спостерігали в легенях потомства F2 з відносно стійким до туберкульозу (C3HeB/FeJxB6.C3H-sstl) F2 після iv MTB-інфекції. У цій сприйнятливій, але генетично гетерогенній гетерогенній популяції sst1 виживання варіювало від 5 до 6 тижнів більше року. Через 15 місяців після зараження семеро тих, хто вижив на тривалий термін, вбили. Живі MTB були виявлені в легенях шляхом застосування гомогенатів органів. Під час гістопатологічного дослідження ми виявили скупчення аномальних великих клітин, що нагадують плоскі клітини, у чотирьох із семи тварин, які були міцно прикріплені один до одного і містили великі атипові ядра. Ці скупчення прилягали до великих запальних уражень, але чітко відрізнялися від оточуючих запальних клітин (рис. 1а, стрілки). Ці клітини позитивно забарвлювали цитокератини 5, 6 і 14 і займали великі сусідні ділянки легені (рис. 1b), тоді як фарбування цитокератинів 1, 8 і 10 було негативним (дані не наведені).

Лускаті клітини в легенях хронічно інфікованих мишей MTB. a ) плоскоклітинний рак легені генетично стійкої (C3HeB/FeJ × B6.C3H-sstl) F2 гібридної миші через 15 місяців після зараження MTB. Фарбування відділів легенів гематоксиліном та еозином (H&E). Стрілки - скупчення плоских клітин. Оригінальне збільшення - × 40, × 200 та × 600 (ліва, середня та права панелі). ( b ) Імуногістохімічний аналіз легеневої тканини миші F2 з використанням антицитокератину 5 (ліва панель), антицитокератину 6 (середня панель) та антицитокератину 14 (права панель) антитіл. Оригінальне збільшення - × 200. ( c ) Легеневі зрізи вродженого штаму миші B6.C3H-sst1, що сприймається на sst1 через 5 місяців після аерозольної інфекції MTB, подвійне фарбування для цитокератину 6 (ліва та середня панелі, початкове збільшення - × 40 та × 400) (відповідно) та кислотостійкі мікобактерії (права панель, × 400). ( d ) Масивний фіброз, пов’язаний з некротичним ураженням легенів мишей B6.C3H-sstl (стрілки). Трихромне забарвлення, оригінальне збільшення - × 40 та × 200, ліва та середня панелі. Права панель - велике скупчення плоских клітин при ураженні туберкульозу легенів. H&E, оригінальне збільшення - × 400.

Повнорозмірне зображення

Далі ми дослідили, чи розвиваються типові некротичні легеневі ураження туберкульозу, що розвинулись у мишей B6.C3H-sst1 після низької дози аерозольної інфекції, плоскоклітинною дисплазією. Через п’ять місяців після зараження MTB були знайдені великі скупчення 6-позитивних клітин цитокератину на краю периферичних уражень туберкульозом (рис. 1в, ліва та середня панелі) поруч із центральною некротичною областю, що містить мікобактерії (рис. 1в, права панель). показали атипову морфологічну картину пухлини ld, права панель) і були оточені масивною фіброзною тканиною (фото ld, ліва та середня панелі).

В обох експериментах нашим попереднім діагнозом була плоскоклітинна метаплазія альвеолярних клітин з можливою злоякісною трансформацією.

Швидкість плоскоклітинної метаплазії контролюється генетично

Ми порівняли випадки метапластичних клітин при ураженнях легенів туберкульозу таких штамів миші: C3HeB/FeJ (чутливий до туберкульозу штам, що несе вихідний відчутний алель локусу sst1), sst1 вроджений B6.C3H-sstl. (помірна чутливість до ТБ) та C57BL/6J (стійкий). Як показано на малюнку 2, після аерозольної інфекції вірулентним МТВ з низькими дозами ці штами відрізнялися виживанням (рис. 2а), здатністю контролювати проліферацію МТБ у легенях (рис. 2б) та ступенем розвитку пневмонії (рис. 2в, показано на малюнку 4). місяці після зараження).). Вигляд плоскоклітинних клітин спостерігався в легенях мишей, інфікованих MTB, шляхом імунофарбування специфічними для цитокератину 6 антитілами, що дозволяє більш чутливо ідентифікувати плоскоклітинні клітини при складних ураженнях ТБ. За допомогою цієї методики в легенях неінфікованих мишей будь-якого штаму не виявлено плоских клітин (не показано).

Масштабована клітинна метаплазія під час туберкульозної інфекції у стійких до MTB штамів мишей. a ) Криві виживання штамів мишей C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl та C57BL/6J після низької дози аерозольної інфекції 30-50 CFU MTB штаму Erdman. ( b ) мікобактеріальне навантаження в легенях штамів мишей C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl та C57BL/6J, визначене застосуванням гомогенатів легенів (CFU - колонієутворюючі одиниці). ( c ) запальні ураження легенів через 4 місяці після аерозольної інфекції (H&E, початкове збільшення - × 40 для верхніх панелей; × 100 для нижніх панелей). ( d ) Аналіз позитивних клітин цитокератину 6 при ураженнях туберкульозу легенів мишей C3HeB/FeJ, B6.C3H-sst1 та B6 (ліва, середня та права панелі) через 4 місяці після зараження (початкове збільшення - × 100),

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Повнорозмірне зображення

Загалом, наші дані показують, що розвиток плоскоклітинної метаплазії є загальною ознакою хронічної туберкульозної інфекції в легенях, тоді як жодна плоскоклітинна клітина не була пов’язана з інфікованими МТВ клітинами селезінки та печінки на будь-якій стадії інфекції (дані не показані ). ).

Плоскоклітинні метаплази призводять до злоякісної трансформації

На основі морфологічних критеріїв плоскоклітинна метаплазія може прогресувати до утворення ССС на пізніх стадіях зараження (рис. 1). Для оцінки проліферативної активності клітин, пов'язаних з метапластичними ураженнями, ми використовували фосфорильовані гістон-специфічні антитіла, які розпізнають ядра мітотичних клітин (Hendzel et al., 1997; Inagaki et al., 1997; Preuss et al., 2003). Через 7 місяців після зараження велика частка клітин, тісно пов'язаних з типовими скупченнями 6-позитивних клітин цитокератину, продемонструвала помітне фарбування ядерним гістоном 3 (рис. 3b). Це спостерігалося при метапластичних ураженнях легенів мишей C57BL/6J та B6.C3H-sstl (рис. 3b, ліва та права панелі).

Оскільки 80% мишей C57BL/6J виявляли ознаки плоскоклітинної метаплазії через 12 місяців після зараження, у деяких з морфологічними ознаками злоякісної трансформації (табл. 1), ми перевірили пухлиногенний потенціал цих клітин безпосередньо трансплантацією клітин, виділених з легенів уражень туберкульозом реципієнтів сингену. Одноклітинну суспензію готували з легенів п’яти мишей C57BL/6J через 12 місяців після зараження MTB шляхом перетравлення колагенази, і приблизно 10 мільйонів невідділених клітин легенів (еквівалентно одній легені) вводили мишам або підшкірно (п’ять тварин), або внутрішньочеревно. (п’ять тварин). Мишам вводили протитуберкульозний препарат ізоніазид (INH) у питну воду для придушення росту MTB. Через 2-3 місяці перенесення клітин ми спостерігали утворення пухлини у 2 з 10 мишей, які отримували легеневі клітини, одну після підшкірної та інтраперитонеальної трансплантації. В якості контролю ми трансплантували одноклітинні суспензії, приготовані з селезінок тих самих мишей, інфікованих MTB, сингенним реципієнтам і не спостерігали жодного пухлинного утворення.

Підшкірну пухлину пересадили вторинному реципієнту, який також через 2 місяці розвинув велику пухлину в місці підшкірної ін’єкції (рис. 3в, верхня ліва панель). На сьогоднішній день проведено три пасажі з інтервалом у два місяці, а в трансплантованих пухлинах не виявлено стійких до кислот мікобактерій. Порівняно з первинними пухлинами легенів, трансплантована пухлина виявляла менш диференційовану морфологію (рис. 3c, нижня ліва панель, H&E) і містила менше 6-позитивних клітин цитокератину (рис. 3c, права панель). Таким чином, після передачі сингенним реципієнтам клітини, отримані від хронічних уражень легенів туберкульозу, індукували трансплантаційну пухлину, яка не потребувала МТВ для свого автономного росту.

Фактори, схильні до плоскоклітинного раку, присутні при ураженні легень туберкульозом

Далі ми хотіли визначити, які з факторів, які можуть бути причиною плоскоклітинної дисплазії, присутні в мікросередовищі легеневих туберкульозних уражень. Одним з факторів зростання, який є критично важливим для розвитку ССС, є епірегулін, потужний член родини епідермальних факторів росту (Toyoda et al., 1997). Ми дослідили експресію гена епігегуліну в легенях мишей C57BL/6J під час зараження MTB за допомогою кількісної RT-PCR загальної легеневої тканини. Як показано на малюнку 4a, експресія епірегуліну була низькою протягом перших 6 місяців зараження і значно зросла до 12 місяців, одночасно з розвитком плоскоклітинної метаплазії та карцином.

Повнорозмірне зображення

Щоб визначити, чи МТБ-інфекція може також викликати експресію епірегуліну в макрофагах, макрофаги, отримані з кісткового мозку, виділено із штамів C57BL/6J (чорні смуги) та штаму B6.C3H-sst1 (білі смужки), інфікованих MTB in vitro та кінетики експресії мРНК епірегуліну аналізували кількісною ПТ-ПЛР. Як показано на малюнку 4c, посилення регуляції мРНК епігегуліну спостерігалося у штамів C57BL/6J та B6.C3H-sstl через 6 годин після зараження MTB. Кінетика експресії мРНК епігегуліну в інфікованих МТБ макрофагах свідчить про те, що її експресія була індукована початковою взаємодією макрофагів з МТБ, мабуть, через платні рецептори.

Далі ми перевірили, чи експресується епірегулін макрофагами уражень легенів туберкульозу in vivo. Дві популяції макрофагів, альвеолярні та інтерстиціальні запальні макрофаги, були виділені з легенів мишей В6 через 12 місяців після зараження МТВ. Альвеолярні макрофаги були виділені бронхоальвеолярним лаважем, а інтерстиціальні (гранульома) макрофаги - шляхом перетравлення інтерстиціальних запальних уражень колагеназою. В обох популяціях макрофаги збагачувались на пластичну адгезію протягом 2 годин, а загальну ізоляцію РНК проводили без подальшої стимуляції. Інтерстиціальні макрофаги експресували мРНК епігегуліну, тоді як у альвеолярних макрофагах не спостерігалось виявлення експресії епігегуліну (рис. 4b). Таким чином, in vivo епірегулін експресувався запальними макрофагами при ураженнях туберкульозу легенів.

Як показано на малюнку 4г, інфіковані МТБ макрофаги є основним джерелом індуцибельної синтази оксиду азоту при ураженнях легенів ТБ (верхні панелі). Реактивні форми кисню та азоту є потужними індукторами окисного пошкодження ДНК. Для оцінки накопичення клітин, що зазнають пошкодження ядерної ДНК поблизу інфікованих МТБ макрофагів, ми пофарбували ураження ТБ антитілами, специфічними для фосфорильованого γ-гистона2АХ, поява яких в ядрах передбачає дволанцюгові розриви ДНК (Bewersdorf et al., 2006) .; Нусценцвейг і Пол, 2006). Фарбування Γ-H2AX показало, що рясне пункційне ядерне фарбування неінфікованих клітин оточувало інфіковані МТВ макрофаги. Ці дані вказують на те, що інфіковані MTB макрофаги мають подвійну дію на клітини, що знаходяться в їх безпосередній близькості, оскільки вони є джерелом ДНК-пошкоджуючих агентів та джерелом факторів росту для виживання.

Щоб визначити, чи вищі мікобактеріальні навантаження чи інші фактори відповідають за швидший розвиток плоскоклітинної дисплазії в легенях мишей B6.C3H-sstl, ми використовували антимікобактеріальну хіміотерапію разом з INH для контролю росту бактерій. Після двомісячного періоду прогресування захворювання ІНГ вводили протягом 3 місяців. На початку лікування INH ми спостерігали розвиток некротичних уражень та приблизно в 500-1000 разів більшу бактеріальну навантаження в легенях вроджених мишей B6C3H-sst1, що є неприйнятним для sst1. Однак в даний час в легенях не спостерігається плоских клітин. Терапія INH зменшила бактеріальне навантаження на органи мишей B6.C3H-sst1 до 500 разів до рівнів, які зазвичай спостерігаються у необроблених мишей C57BL/6J. Тим не менше, цитокін 6-позитивні метапластичні клітини легко виявити в легенях двох з трьох мишей B6C3H-sstI (рис. 5). В однієї тварини ми спостерігали запущені стадії метаплазії, що прилягають до великих скупчень інфікованих MTB макрофагів (рис. 5а-с, ліві 2 панелі, миша №1). Тим часом легені іншої миші представляли більш ранню стадію метаплазії з невеликими скупченнями 6-позитивних клітин цитокератину, які асоціюються із запальною тканиною, яка не містила жодної кислотостійкої бацили (рис. 5а-с, права панель).

Лускатоклітинна дисплазія, пов’язана з ураженням туберкульозу легенів після антимікобактеріальної хіміотерапії ізоніазидом (INH). Конгенні миші C57BL/6J та B6.C3H-sstl були заражені 50 000 CFU MTB. Через 2 місяці зараження тварини отримували INH у питній воді (0,1 мг/мл) ще 3 місяці. Тварин забивали через 7 днів після закінчення хіміотерапії INH. Бактеріальне навантаження на легені мишей B6.C3H-sstl коливалося від 5 х 104 (миша №2) до 20 х 104 КУО (миша №1) після лікування. На той час MTB був нижче рівня виявлення (