Parasitol Latinoam 62: 79-82, 2007 FLAP

КОМУНІКАЦІЇ

Метод культури личинок мух Lucilia sericata для терапії личинок

МЕТОД КУЛЬТУРИ ДЛЯ Lucilia sericata ЛЕТЯЧІ ЛАРВИ ДЛЯ ВИКОРИСТАННЯ В МАГОГОТЕРАПІЇ

LUIS FIGUEROA *, JORDANA FLORES * і SANDRA RODR SGUEZ *

* Інститут паразитології, медичний факультет, Австралійський університет Чилі. Кампус Ісла-Тея. Вальдівія. Вставка 567. Телефон: 63-221499. Факс: 63-214475.

Загальними цілями дослідження були: 1) Опишіть цикл розвитку Росії Lucilia sericata (Calliphoridae), на їх стадії яйцеклітини, личинки, лялечки та імаго та 2) Адаптуйте техніку для дезінфекції нових L. sericata і подальше отримання стерильних личинок. Контроль розвитку здійснювався шляхом щоденного визначення різних його стадій. Для техніки дезінфекції яйця послідовно занурювали у розчини 0,5% гіпохлориту натрію та 10% формаліну, а потім промивали 0,15 М NaCl. Для контролю якості дезінфекції зразок яєць розподіляли в соєвому агарі Trypticase з 5% крові та звичайного відвару.

Розвиток Росії L. sericata в лабораторії він показав, що яйця та їх вилуплення у личинок відбувалися (середнє значення ± стандартне відхилення) через 15 ± 3,5 години, тоді як від личинок до лялечок 138 ± 17 годин та від лялечок до дорослих особин 126 ± 21 години. Техніка знезараження яєць L. sericata показав ефективність 87%.

Загальними цілями цього дослідження були: 1) Опишіть цикл розвитку Росії Lucilia sericata (Calliphoridae), хоча яйцеклітина, личинка, лялечка та імаго стадії, і 2) Розробити метод знезараження яєць L. sericata. Процес розвитку цієї мухи спостерігався щодня, визначаючи час, необхідний для появи кожної різної стадії. Техніка дезінфекції включала послідовну обробку яєць у розчинах 0,5% гіпохлориту натрію та 10% формаліну після отримання яєць шляхом експериментального схрещування чоловічих та жіночих мух у лабораторії. Потім яйця промивали в стерильних 0,15 MNaCl, а зразки яєць викладали на соєвий агар триптикази, що містить 5% овечої крові, а також інокулювали в поживний бульйон. L. sericata вилуплюються через 15 ± 3,5 год, утворюючи лялечки через 138 ± 17 год, а дорослі з’являються через 126 ± 21 год. Техніка дезінфекції, використана в цьому дослідженні, була ефективною на 87%. Був зроблений висновок, що повний розвиток, а також дезінфекція яєць можуть бути успішно проведені в лабораторії для виробництва личинок, корисних при терапії опаришем.

Ключові слова: Lucilia sericata, терапія опаришем, муха, Чилі.

ВСТУП

Терапія личинками видаляє некротичну тканину, сприяє росту тканин і покращує швидкість загоєння. Найчастіше в терапії личинками застосовуються мухи, що належать до сімейства Calliphoridae, які мають кілька вигідних біологічних властивостей 1 .

З цієї групи вид, з яким ми працюємо, є Lucilia sericata упирі, що харчуються мухою, і один з переважаючих видів у трупній фауні 1011. Вони космополітичні і частіше трапляються в літні місяці 23 .

L. sericata Це муха середнього розміру, яку легко впізнати за металевим забарвленням тіла (зеленим), особливо на животі 4 .

Розведення цих упирів технічно просто. Для його належного управління необхідно знати еволюційний цикл виду, а також його потреби в їжі, температурі та вологості 5 .

У нашому середовищі досвід такого виду лікування майже невідомий і дуже мало цінується через шкідливі культурні проблеми, які змушують нас ігнорувати позитивні сторони цього виду альтернативної терапії.

Мета цього дослідження - внести свій внесок у пізнання личинкової терапії, а також біологічного циклу L. sericata, і продемонструвати, що можна відтворити цей цикл в лабораторії для отримання знезаражених яєць.

МАТЕРІАЛ І МЕТОД

Для збору мух використовували 6 пасток Ferreira. Використовували банку діаметром 150 мм і висотою 200 мм, чорного кольору. На периферії основи було зроблено 12 отворів діаметром 13 мм, розташованих по колах (через які входили мухи). На дно банки поміщали пластиковий горщик для наживки. Зверху цього горщика був конус, який мав діаметр основи 150 мм і верхній отвір діаметром 35 мм. Поліетиленовий пакет (в якому знаходились затиснуті мухи) був поміщений над верхнім отвором банки. (Фігура 1). Пастки були підвішені на відстані 1 метра від землі, в місцях, відкритих сонячним променям. В якості приманки використовували нутрощі та залишки риби. Для класифікації використовувались уже встановлені таксономічні ключі 7 .

Клітки були побудовані з дротяних кубиків розміром 500 х 500 х 500 мм, покритих москітною сіткою. З одного боку розміщений легкий матеріальний рукав, достатньо довгий для роботи всередині. У нижній частині клітини є піддон з водою, щоб підтримувати вологість і уникати надлишку алергенного матеріалу, що потрапляє в навколишнє середовище.

У годівлі мух використовували цукровий пісок та сухе молоко (як джерело білка), розміщених у лунках. Перевернутий стакан води на чашці Петрі з абсорбуючим паперовим рушником забезпечує водою, не покриваючись грибком.

Шматочки печінки, поміщені на дно темних ПВХ-трубок, забезпечували субстрат, в який мухи відкладали яйця. Таким чином було запропоновано темне та захищене середовище, з яким легко збиратись. Яйця збирали щодня 8 .

В середньому кожна з чотирьох кліток містила 500-1000 мух. Мух додавали в клітини щотижня, щоб заселити 8 .

Камера для личинок була виконана з пластикових горщиків з герметичною кришкою. У центрі кришки було вирізано простір, який було покрито тонкою тканиною, що дозволяла оксигенацію. Горщик наполовину заповнений дрібними тирсою. Усередині шматочок печінки служить субстратом, на який можна відкласти яйця, нещодавно відкладені мухами. Коли личинки вилуплюються, вони поглинають печінку і проходять три свої стадії личинки перед тим, як потрапити в тирсу для окукливания. Дорослі з’являються після лялечок, а горщики залишають у клітках, щоб збільшити свою популяцію 8. Визначити часи розвитку еволюційного циклу Росії L. sericata Розробку відтворювали 8 разів, проводячи щоденний контроль, визначаючи різні її етапи.

sericata

Фігура 1. Мухоловка.

Щодо дезінфекції личинок, вони народжуються стерильними, коли яйця продезінфікували і помістили в стерильний контейнер. Самки відкладають яйця в масі разом із зв’язуючою речовиною, тому перед дезінфекцією їх потрібно відокремити, замочивши їх у певному типі миючих засобів, таких як сульфат натрію або гіпохлорит натрію. .

У нашій роботі дезінфекція проводилася за методикою, встановленою в 1998 році 9. Найкращий результат був отриманий промиванням і струшуванням комерційним гіпохлоритом натрію, розведеним на 0,5%, для дисоціації яєць, а потім стерилізацією протягом 5 хвилин 10% формаліном. нарешті, було проведено 3 - 4 полоскання стерильним фізіологічним розчином. Весь цей етап проводився в стерильному полі за основних асептичних заходів.

Стерильність яєць забезпечували культивуванням їх при 27 ° C на соєвому агарі-триптиказі та кров’яному агарі як взаємозамінний, на додаток до звичайного бульйону. Розвиток бактерій або забруднення грибів контролюється через 24 - 48 годин. Крім того, під час кожної стерилізації яйця культивували на триптозному бульйоні, тому що будь-які ознаки забруднення помутнінням легко виявити, і таким чином усунути тих личинок, які були заражені.

Проведено 100 контрольних процесів розпаду та дезінфекції яєць, вимірюючи відсоток стерильних живих личинок за 48 годин інкубації.

Було визначено час зберігання життєздатних стерильних личинок при 4 o C.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Визначення виду L. sericata Для вивчення та розвитку методу розведення та розмноження він базувався на його космополітичному характері та на успішному досвіді інших авторів, демонструючи свою ефективність у очищенні ран 1 .

Щоб визначити час, необхідний для розвитку циклу, ми проводимо щоденний контроль, визначаючи різні його стадії (ми повністю відтворили життєвий цикл L. sericata) Отримавши в результаті, що мухи після копуляції розміщують яйця безпосередньо у джерелі їжі, де їх вилуплення у личинок відбулося (середнє ± стандартне відхилення) через 15 ± 3,5 години, тоді як від стадії личинки до лялечок було 138 ± 17 годин і від лялечок до дорослих, 126 ± 21 год. Дані, що узгоджуються з автором 13. Все це залежить від змінної температури та наявності води та їжі.

За умов нашої лабораторії: Температура 25 ° C, приблизно 50% вологості повітря, постійне підтримання їжі та води, розвиток біологічного циклу L. sericata від яйця до імаго становив 11,6 днів.

Яйцеклітини виймали з кліток щодня, повторне заселення клітини проводили щотижня, щоб відновити загублені екземпляри та утримувати мух завжди у період найвищої продуктивності, тобто між другим і четвертим тижнем життя 8 .

При розпаді яєць від їх зв’язуючої речовини найкращі результати були отримані шляхом занурення їх на 3 хвилини в 0,5 Na гіпохлориту, а потім дезінфекції у 10% формаліні на 5 хвилин при постійному перемішуванні.

Дуже важливо, щоб після кожного з цих етапів яйця промивали стерильним 0,15 М NaCl. У цьому випадку було проведено від 3 до 4 прань.

Щоб підтвердити, що процес дезінфекції був успішним, на основі того, що вже було запропоновано 8, ми провели 100 тестів дезінфекції та контролю якості з використанням соєвого агару трипікази, доданого або не містить 5% крові, це сприятливе середовище для яйцеклітини та її виведення личинкам, оскільки вона може ними харчуватися, крім того, що дозволяє нам перевірити, чи існує якийсь тип забруднення. Крім того, у кожній культурі яєць використовували бульйон триптози для виявлення забруднення через помутніння середовища. Часові рамки для визначення успіху дезінфекції становили від 24 до 48 годин, якщо після закінчення цього періоду не було забруднення, ми могли б забезпечити стерильність середовища, а отже, і личинок, перевіряючи таким чином, чи можливо їх використовувати в личинках терапія.

Після проведення дезінфекції визначали відсоток живих личинок, оцінюючи кількість яєць, відкладених на агаровій пластині, які залишалися живими через 48 годин. Було отримано 4% живих личинок, які залишались дезінфікованими лише до 24 годин інкубації, 87%, які залишались дезінфікованими більше 48 годин, і лише 9% із 100 проведених контрольних досліджень не мали патогенних мікробів. (Температура інкубації становила 26 ° - 28 ° C).

Іншим елементом, необхідним для визначення, був час збереження життєздатних стерильних личинок. Як зазначено 8, личинки могли охолоджуватися до 5 днів при 4 o C, оскільки з цього часу загибель личинок перевищувала 50%. 10 зразків було випадковим чином розділено (з урахуванням того, що вони були дезінфіковані після 48 годин інкубації) від 100 проведених контролів і доведено до 4 o C протягом 5 днів. Згодом їх перенесли до розплідника при 25 ° C із шматочком бичачої печінки для визначення її життєздатності. Через пару годин личинки відновили свою повну активність і почали поглинати їжу, що дозволило їм досягти стану імаго і дати нам впевненість, що продезінфіковані личинки можна зберігати в холодильнику максимум 5 днів, оскільки після цієї життєздатності втрачається на великий відсоток.

ЛІТЕРАТУРА

1 ШЕРМАН РА, ЗАЛ М Й Р, ТОМАС С. Лікувальні опариші: Давній засіб проти деяких сучасних напастей. Ann Rev Entomol 2000; 45: 55-81. [Посилання]

2 SHINKMAN Р. Личинки, п’явки повертаються в сучасну медицину. Mod Healthcare 2000; 20: 54-5. [Посилання]

3 GUIMARÁES J H, PAPAVERO N, PRADO P. As miíases na regiáo Neotropical (ідентифікація, біологія, бібліографія). Revta Bras Zool 1983; 1: 239-416. [Посилання]

4 KETTLE DS. Медична та ветеринарна ентомологія. Друге видання. Кафедра ентомології. Квінслендський університет. Австралія 1995: 53. [Посилання]

5 SHERMAN R A, WYLE AF. Недороге вирощування опаришів у лікарнях, клініках та школах. Am J Med HYG 1996; 54: 38-41. [Посилання]

6 GUIMARÁES J H, PAPAVERO N, PRADO P. As miíases na regiáo Neotropical (ідентифікація, біологія, бібліографія). Revta Bras Zool 1983; 1: 239-416. [Посилання]

7 GREENBERG B. Мухи та хвороби. Екологія, класифікація та біотична асоціація. США: Princeton University Press 1971; Том I: 1-856. [Посилання]

8 SHERMAN R A, WYLE A F. Недороге вирощування опаришів, що обслуговується, у опаленнях у лікарнях та школах. Am J Med HYG 1996; 54: 38-41. [Посилання]

9 MUMCUOGLU K Y, INGBER A, GILEAD L, et al. Терапія опаришем для лікування діабетичної виразки стопи. Diab Care 1998; 21: 2030-1. [Посилання]

10 FIGUEROA L, LINHARES A. Синантропія Calliphoridae (Diptera) з Вальдівії. Чилі. Neotropica Entomol 2002; 31 (2): 233-9. [Посилання]

11 ATIAS A. Медична паразитологія. Медичний факультет Чилійського університету 1999; 450-64. [Посилання]

Робота, що фінансується Дирекцією досліджень та розробок Австралійського університету Чилі (проект DID: S-2003-55).

Листування на: e-mail: [email protected]

Весь вміст цього журналу, крім випадків, коли він ідентифікований, підпадає під ліцензію Creative Commons

Сантьяго 1, Чилі

Тел .: 56-2- 9785500


[email protected]