предмет

  • реферат
  • Головний
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Учасники дослідження
  • Зразки крові
  • Аналіз амінокислот плазми за допомогою ААА
  • Аналіз амінокислот із висушених плям крові методом ВЕРХ з флуорометричним детектуванням
  • Аналіз амінокислот із висушених плям крові тандемом MS/MS
  • Дієтний рейтинг
  • Статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • ОБГОВОРЕННЯ

реферат

Мета: Моніторинг рівня фенілаланіну в крові має вирішальне значення для лікування фенілкетонурії. Ми порівняли три методи вимірювання концентрації фенілаланіну в крові: аналізатор амінокислот, високоефективна рідинна хроматографія з флуорометричним детектуванням та тандемна мас-спектрометрія.

Методи: Ми вивчили 22 пацієнтів з фенілкетонурією у віці 12-48 років, які брали участь у нашому метаболічному таборі. Кров збирали в гепаринізовані пробірки (для аналізу з використанням аналізатора амінокислот) або на фільтрувальному папері (для аналізу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з флуорометричною детекцією та тандемною мас-спектрометрією).

Результати: Концентрація фенілаланіну в плазмі крові, виміряна аналізатором амінокислот, була значно вищою, ніж концентрація, отримана з цільної крові на фільтрувальному папері за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (різниця: 102 мкМ; 95% довірчий інтервал: 23, 181) та тандем мас-спектрометрія (різниця: 137 мкМ 95% довірчий інтервал: 58, 216). Концентрації фенілаланіну в результаті високоефективної рідинної хроматографії та тандемної мас-спектрометрії суттєво не відрізнялися (P = 0,5).

Висновки: Під час моніторингу рівня фенілаланіну в крові на предмет дотримання їжі лікарі повинні знати про застосовуваний метод; аналізи цільної крові на фільтрувальному папері були приблизно на 15% нижчі, ніж аналізи плазми.

Головний

Фенілкетонурія (ФКУ) - це вроджений метаболічний дефект, що виникає внаслідок рецесивної генетичної мутації, як правило, у гені, що кодує фенілаланінгідроксилазу, фермент, відповідальний за гідроксилювання амінокислоти фенілаланін (Phe) до тирозину (Tyr), важливого проміжного продукту у виробництві нейромедіатори. Якщо їх не лікувати, метаболіти ФКУ Phe накопичуються, а нейромедіатори зменшуються, що призводить до розумової відсталості, порушень поведінки та судом. Однак цей негативний ефект можна успішно запобігти дієтичним лікуванням, якщо його розпочати протягом перших кількох днів життя, так що всі держави тепер включають ФКУ у свої скринінгові панелі для новонароджених.

Хоча універсальних вказівок немає, загальновизнаним підходом до лікування ФКУ є сувора дієта, яка містить кількість інтактного білка, необхідного для підтримання концентрації Phe в крові в межах терапії, і доповнена метаболічною формулою, що не містить Phe (тобто медичною дієта). ), щоб концентрація Phe у крові не перевищувала 360 мкМ (6 мг/дл; для перетворення мкМ в мг/дл, розділене на 60) принаймні 6-річного віку. 1 Більш низькі концентрації Phe були пов'язані з нормальними когнітивними здібностями у підлітків та дорослих, що свідчить про те, що оптимальні результати можна отримати, коли рівень Phe підтримується на рівні 120-360 мкМ протягом 12 років та 120-900 мкМ. 2 Суворий контроль рівня Phe в крові також є критичним під час вагітності; дитина, народжена від матері, ФКУ якої не знаходиться під контролем метаболізму, може страждати від розумової відсталості, мікроцефалії та вродженої серцевої недостатності. 3

Прагнення до харчових звичок протягом усього життя означає критичну потребу у простих, швидких і точних методах контролю рівня Phe в крові. Простий скринінговий метод скринінгу новонароджених ФКУ, тест на інгібування бактерій Guthrie4, використовується вже більше чотирьох десятиліть. З тих пір було розроблено кілька нових методів, включаючи аналізатор амінокислот (AAA), флуорометрію, 5 високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ), 6, 7 та тандемну мас-спектрометрію (MS/MS). 8, 9 Ці нові методи виявилися життєво важливими для підвищення точності та швидкості скринінгу новонароджених, 10, 11, але мало досліджень обґрунтовували обґрунтованість цих методів для кількісного аналізу абсолютних концентрацій Phe в крові, необхідних для стежити за пацієнтами.

Пацієнти з ФКУ різняться між собою за кількістю активного ферменту, смаковими уподобаннями лікарської їжі та готовністю дотримуватися призначеної дієти. Усі ці фактори роблять лікування дуже індивідуалізованим і моніторинг критичним. У відділі медичної генетики Університету Еморі ми регулярно зустрічаємо пацієнтів з ФКУ в метаболічних клініках та щорічному літньому таборі, де кров збирається та аналізується за допомогою ААА. Між цими візитами пацієнти беруть відбитки пальців вдома, наносять кров на фільтрувальний папір і відправляють зразок до нашої клініки, де його аналізують за допомогою ВЕРХ або пізніше за допомогою MS/MS. Оскільки у того самого пацієнта, ймовірно, аналіз крові проводиться за допомогою ААА та ВЕРХ, або МС/МС, або, мабуть, за всіма трьома методами, які в даний час використовуються в наших лабораторіях, ми були зацікавлені у порівнянні концентрацій Phe у крові, отриманих за допомогою цих трьох методів. Таким чином, нашою метою було проаналізувати порівняння трьох методів (плазми ААА та ВЕРХ та МС/МС у фільтрах цільної крові) для моніторингу концентрації Phe у крові.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Учасники дослідження

Метаболічний табір для дівчат при Університеті Еморі був створений в 1994 році для задоволення потреб підлітків, яким доводиться справлятися із дотриманням обмежувальної дієти та необхідної концентрації Phe в крові. Найважливішим було націлювання на 12 дівчат-підлітків через потенційно шкідливий вплив поганого метаболічного контролю на їх потомство; наші новіші табори розширились і охопили жінок різного віку. Кемпінги проводять тиждень у будинку в університетському містечку з дослідниками та дієтологами з метаболізму, які служать "консультантами з кемпінгу". Заходи в таборах включають ПКУ та дієтичне навчання, заняття кулінарією, приготування лікувальних страв, вибірку нових добавок та соціальні поїздки. Дані для цього аналізу були отримані від учасників щотижневого табору 2004 року: 25 дівчат та жінок у віці 12-48 років.

Зразки крові

Під час першого та останнього ранку табору учасники відвідали Загальний клінічний дослідницький центр університету Еморі (GCRC), де вимірювали їх зріст та вагу. Кров збирали (2-3 мл) у гепаринізовану пробірку для аналізу за допомогою ААА та безпосередньо на фільтрувальний папір з пробірок для збору крові для аналізу за допомогою ВЕРХ з флуорометричним детектуванням, стрижень MS/MS. Батьки (якщо відпочиваючим було менше 18 років) або відпочиваючі дали інформовану згоду перед початком табору, і всі збори даних були схвалені Інституційною комісією з огляду університету Еморі.

Аналіз амінокислот плазми за допомогою ААА

Для аналізу амінокислот ми використовували AAA Beckman 6300 AAA, оснащений вбудованим колориметричним детектором, як описано раніше 13, з незначними модифікаціями. Зразки плазми депротеїнізували рівним об'ємом 6% сульфосаліцилової кислоти, а 400 мкл супернатанту змішували з 500 мкл літієвого В буфера та 100 мкл 0,25 мМ S-аміноетилцистеїну (SAEC) перед аналізом. Зразок вводили у високоефективну катіонообмінну колонку Бекмана (10 х 0,4 см), а вільні амінокислоти відокремлювали, використовуючи комбінацію літієвих буферів А, D, Е та F Бекмана Култера (рН від 2,9 до 3,9) з програма змінного іонообміну. ​​сила та температура. Потім амінокислоти вимірювали колориметрично при 570 та 440 нм після дериватизації після колонки нінгідрином. Як калібратор використовували стандартну суміш Бекмана. Програмне забезпечення Beckman System Gold було використано для ідентифікації та кількісної оцінки амінокислот, присутніх у зразку, на основі їх відповідного часу утримання та значень поглинання.

Аналіз амінокислот із висушених плям крові методом ВЕРХ з флуорометричним детектуванням

Аналіз амінокислот із висушених плям крові тандемом MS/MS

Коло діаметром 3 мм вибивали з фільтрувального паперу, що містив зразок крові, і екстрагували 100 мкл метанолу, що містить стабільні ізотопно мічені внутрішні амінокислотні стандарти, протягом 20 хвилин обробкою ультразвуком. Після випаровування розчинника амінокислоти бутилювали 3 N бутанолом HCl протягом 15 хвилин при 65 ° C. Після випаровування насухо зразки повторно розчиняли в 100 мкл рухомої фази (80% ацетонітрилу). Для аналізу MS/MS використовували мікротандемний мас-спектрометр Micromass Quattro із системою ВЕРХ Waters 2795. Швидкість потоку LC програмували з початковою швидкістю потоку 0,15 мл/хвилину, 0,12 хвилини = 0,04 мл/хвилину, 1,1 хвилини = 0,6 мл/хвилину та 1,2 хвилини = 0,15 мл/хвилину, а потім 0,8 хвилини рівноваги з початковим потоком для наступної ін’єкції. Нейтральні втрати 102 в режимі позитивної іонізації електророзпиленням виявили L-Phe і L-Tyr. Параметрами мас-спектрометра були напруга капіляра при 3,5 кВ і напруга конуса при 35 В, а енергія зіткнення - 25 В. Газом зіткнення був аргон. Інтенсивність L-Phe та L-Tyr порівнювали з їх стабільними ізотопами, позначеними внутрішніми стандартами. Для аналізу даних було використано програмне забезпечення NeoLynx.

Дієтний рейтинг

Кемпери заповнювали 3-денні записи про їжу протягом 3 днів безпосередньо перед першим днем ​​табору, які ми потім аналізували за допомогою програмного забезпечення Ross AAA (версія 3.1, 1997, Ross Products Division, Columbus, OH).

Статистичний аналіз

SAS (версія 9.1, SAS Institute, Cary, NC) використовували для всіх статистичних аналізів. Ми виключили трьох кемперів за неповні дані (вони мали ранкові ранкові рейси і покинули місце перед відвідуванням GCRC для вимірювання та збору крові), щоб отримати остаточний розмір вибірки n = 22. Для кожного з цих трьох методів всі зразки аналізували в дублікат і вживаний. середній. Для порівняння цих трьох методів ми розрахували різницю середніх значень найменших квадратів (PROC MIXED в SAS) і створили різницеві графіки Бленда-Альтмана. 15 с

Діаграма Бленда-Альтмана процентної різниці в концентрації фенілаланіну (аналізатор амінокислот - високоефективна рідинна хроматографія) порівняно із середньою концентрацією фенілаланіну, визначеною цими двома методами. Середня різниця у відсотках позначається суцільною лінією, а 95% межами - пунктиром.

Повнорозмірне зображення

Графік Бленда-Альтмана щодо процентної різниці концентрацій фенілаланіну (аналізатор амінокислот - тандемна мас-спектрометрія) порівняно із середньою концентрацією фенілаланіну, визначеною цими двома методами. Середня різниця у відсотках позначається суцільною лінією, а 95% межами - пунктиром.

Повнорозмірне зображення

Діаграма Бланд-Альтмана процентної різниці в концентрації фенілаланіну (високоефективна рідинна хроматографія - тандемна мас-спектрометрія) порівняно із середньою концентрацією фенілаланіну, визначеною двома методами. Середня різниця у відсотках позначається суцільною лінією, а 95% межами - пунктиром.

Повнорозмірне зображення

ОБГОВОРЕННЯ

Ми виявили суттєві відмінності в концентраціях Phe у крові, виміряних AAA, HPLC та MS/MS. Аналіз AAA в плазмі дав найвищі значення концентрації Phe в крові; ВЕРХ та МС/МС, в яких використовувались зразки крові з фільтрувального паперу, статистично не відрізнялись між собою, а концентрації Phe постійно були приблизно на 12% нижчі для ВЕРХ та 19% нижчі для РС/МС порівняно з ААА. Концентрації Phe в крові, отримані цими трьома методами, є достатньо різними, щоб мати реальний клінічний вплив, оскільки різні значення, ймовірно, спричинять помітні корекції дієти або метаболічних продуктів з боку клініциста або дієтолога з метаболізму, особливо при більш високих концентраціях Phe.

У цьому аналізі ми порівняли три методи з використанням зразків крові (плазми або фільтрувального паперу), підготовлених та проаналізованих, як це робиться для контролю концентрації Phe у наших лабораторіях; ми порівнювали аналіз плазми та цільної крові на фільтрувальному папері для того самого методу. Крім того, наші зразки крові з фільтрувального паперу спостерігали за зразком венозної крові, взятим у кожного каравана, а не за відбитками пальців; тому ці зразки не є повною мірою репрезентативними для тих, які були б надіслані нам для рутинного моніторингу. Ми вирішили використовувати венозні зразки лише для того, щоб уникнути непотрібного напруження наших автофургонів від решти молотків та забезпечити повне та послідовне насичення фільтрувального паперу кров’ю.

Наш аналіз був підкріплений порівняно великою вибіркою дівчат та жінок із ФКУ, у яких відбирали зразки крові натще, і протягом двох моментів лікарі-флеботоми навчали безпосередньо на фільтрувальному папері в Загальному клінічному дослідницькому центрі. Наші результати наголошують на необхідності ознайомлення тих, хто бере участь у моніторингу концентрацій Phe, із методологією, яка використовується як отримані результати. Подальші дослідження необхідні для порівняння кількісного визначення концентрацій Phe у плазмі крові та цільної крові на фільтрувальному папері з використанням цих різних методологій; Краще розуміння відмінностей в аналітичних методах моніторингу Phe є важливим для розробки керівних принципів для лікарів та дієтологів з метаболізму, що працюють з пацієнтами з ФКУ.