крові

  • Резюме
  • Довіритель
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Учасники дослідження
  • Зразки крові
  • Аналіз амінокислот плазми методом ААА
  • Амінокислотний аналіз висушених плям крові методом ВЕРХ із флуорометричним детектуванням
  • Амінокислотний аналіз тандемних сухих плям крові на РС/РС
  • Дієтична оцінка
  • статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • ОБГОВОРЕННЯ

Резюме

Призначення: Моніторинг фенілаланіну в крові є критичним для лікування фенілкетонурії. Ми порівняли три методи вимірювання концентрації фенілаланіну в крові: аналізатор амінокислот, високоефективна рідинна хроматографія з флуорометричним детектуванням та тандемна мас-спектрометрія.

Методи: Ми вивчили 22 пацієнтів з фенілкетонурією у віці від 12 до 48 років, які відвідували наш метаболічний табір. Кров збирали в гепаринізовані пробірки (для аналізу за допомогою аналізатора амінокислот) або фільтрувальний папір (для аналізу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з флуорометричним детектуванням та тандемною мас-спектрометрією).

Результати: Плазмові концентрації фенілаланіну в крові, виміряні аналізатором амінокислот, були значно вищими, ніж концентрації цільної крові на фільтрувальному папері за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (різниця: 102 мкМ; 95% довірчий інтервал: 23, 181) та тандемної маси спектрометрія (різниця: 137 мкМ; 95% довірчий інтервал: 58, 216). Концентрації фенілаланіну в результаті високоефективної рідинної хроматографії та тандемної мас-спектрометрії суттєво не відрізнялися (P = 0,5).

Висновки: При моніторингу концентрації фенілаланіну в крові на відповідність дієті клініцисти повинні враховувати застосовуваний метод; Аналізи цільної крові на фільтрувальному папері постійно були приблизно на 15% нижчими, ніж аналізи плазми.

Довіритель

Фенілкетонурія (ФКУ) - це вроджена метаболічна помилка, яка виникає внаслідок рецесивної генетичної мутації, як правило, у гені, який кодує фенілаланінгідроксилазу, фермент, відповідальний за гідроксилювання амінокислоти фенілаланін (Phe) до тирозину (Tyr), що є важливим фактором. проміжне у виробництві нейромедіаторів. Якщо ФКУ не лікувати, метаболіти Phe накопичуються, а нейромедіатори зменшуються, що призводить до розумової відсталості, порушень поведінки та судом. Однак ці негативні наслідки можна успішно запобігти за допомогою дієтичного лікування, якщо його розпочати в перші дні життя, саме тому всі держави зараз включають ФКУ у свої скринінгові панелі для новонароджених.

Хоча не існує універсальних вказівок, загальновизнаний підхід до управління ФКУ - це сувора дієта, яка включає кількість інтактного білка, необхідного для підтримання концентрації Phe у крові в діапазоні лікування, і доповнення метаболічною формулою, що не містить Phe (тобто медичне харчування). так, щоб концентрація Phe у крові не перевищувала 360 мкМ (6 мг/дл; для перетворення мкМ у мг/дл, розділити на 60) принаймні до 6 років. 1 Більш низькі концентрації Phe були пов'язані з нормальними когнітивними здібностями у підлітків та дорослих, що вказує на те, що оптимальні результати можуть бути отримані, коли рівень Phe підтримується на рівні 120-360 мкМ до 12 років та 120-900 мкМ відтоді. 2 Суворий контроль концентрації Phe в крові також є критично важливим під час вагітності; дитина, яка народилася від матері, ФКУ якої не знаходиться під контролем метаболізму, може страждати розумовою відсталістю, мікроцефалією та вродженою серцевою недостатністю. 3

Прагнення дотримуватися дієти протягом усього життя означає критичну потребу у простих, швидких та точних методах контролю концентрації Phe у крові. Простий метод скринінгу на ФКУ у новонароджених, Аналіз інгібування бактерій Гатрі, 4 використовується вже більше чотирьох десятиліть. З тих пір було розроблено кілька нових методів, включаючи аналізатор амінокислот (AAA), флуорометрію, 5 високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ), 6, 7 та тандемну мас-спектрометрію (MS/MS). 8, 9 Показано, що ці нові методи мають життєво важливе значення для підвищення точності та швидкості скринінгу новонароджених, 10, 11, але мало досліджень обґрунтовували обґрунтованість цих методів для кількісного аналізу концентрацій. Абсолютні рівні Phe у крові необхідний для спостереження за пацієнтом.

Хворі ФКУ різняться між собою кількістю активного ферменту, смаковими уподобаннями до лікувальних продуктів та готовністю дотримуватися встановленої дієти. Усі ці фактори роблять лікування дуже індивідуалізованим і моніторинг критичним. У відділі медичної генетики університету Еморі ми регулярно бачимо пацієнтів з ФКУ в метаболічних клініках та на щорічному літньому таборі, де ААА бере кров і проводить аналіз крові. Між цими візитами пацієнти роблять домашні уколи, фарбують кров на фільтрувальному папері та відправляють зразок до нашої клініки, де його аналізують за допомогою ВЕРХ або, нещодавно, за допомогою MS/MS. Оскільки той самий пацієнт, швидше за все, тестує свою кров за допомогою ААА та ВЕРХ або МС/МС, або, можливо, всіх трьох методів, що використовуються в даний час у наших лабораторіях, ми були зацікавлені у порівнянні концентрацій Phe у крові, отриманих за допомогою цих трьох методів. Отже, нашою метою було проаналізувати порівняння трьох методів (плазмовий ААА та ВЕРХ та фільтрувальний папір з цільною кров’ю MS/MS) для моніторингу концентрації Phe у крові.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Учасники дослідження

Метаболічний табір для дівчат в Університеті Еморі був створений в 1994 році для задоволення потреб підлітків, які повинні впоратися із дотриманням обмежувального харчування та бажаної концентрації Phe в крові. 12 Спершу напали на дівчат-підлітків через потенційно шкідливі наслідки поганого метаболічного контролю у їхніх нащадків; Наші новітні табори були розширені, включаючи жінок різного віку. Кемпінги проводять тиждень, проживаючи в будинку в університетському містечку, разом із дослідниками метаболізму та дієтологами, які служать "радниками табору". Заходи в таборі включають ПКУ та навчання дієти, курси кулінарії, приготування лікувальної їжі, нові зразки добавок та соціальні виходи. Ми отримали дані для цього аналізу від учасників однотижневого табору в 2004 році: 25 дівчат та жінок у віці від 12 до 48 років.

Зразки крові

Першого та останнього ранку табору учасники відвідали Загальний клінічний дослідницький центр університету Еморі (GCRC), де вимірювали їхній зріст та вагу. Кров (2-3 мл) збирали в гепаринізовану пробірку для аналізу ААА і поміщали безпосередньо на фільтрувальний папір із пробірки для збору крові для аналізу ВЕРХ за допомогою флюометричного стрижня MS/MS. Батьки (коли кемпери не досягли 18-річного віку) або кемпінги дали інформовану згоду перед табором, і весь збір даних був схвалений Інституційною комісією з огляду університету Еморі.

Аналіз амінокислот плазми методом ААА

Ми використовували Beckman 6300 AAA, оснащений онлайновим колориметричним детектором для аналізу амінокислот, як описано вище 13 з незначними модифікаціями. Зразки плазми депротеїнізували рівним об'ємом 6% сульфосаліцилової кислоти, а 400 мкл супернатанту змішували з 500 мкл літієвого буфера В та 100 мкл 0,25 мМ S-аміноетилцистеїну (SAEC) перед аналізом. Зразок вводили у високоефективну катіонообмінну колонку Бекмана (10 × 0,4 см), а вільні амінокислоти відокремлювали за допомогою комбінації літієвих буферів А, D, Е та F Бекмана Култера (діапазон від pH 2, 9 до 3.9) із програмою змінної іонної сили та температури. Потім амінокислоти вимірювали колориметрично на довжинах хвиль 570 і 440 нм після дериватизації після колонки нінгідрином. В якості калібратора використовували стандартну суміш Бекмана. Програмне забезпечення Beckman System Gold було використано для ідентифікації та кількісної оцінки амінокислот, присутніх у зразку, на основі їх відповідного часу утримання та значень поглинання.

Амінокислотний аналіз висушених плям крові методом ВЕРХ із флуорометричним детектуванням

Амінокислотний аналіз тандемних сухих плям крові на РС/РС

Дієтична оцінка

Кемпери заповнювали 3-денні записи про їжу протягом 3 днів, що передували першому дню табору, які ми потім проаналізували за допомогою програмного забезпечення Ross AAA (версія 3.1, 1997, Ross Products Division, Columbus, OH).

статистичний аналіз

SAS (версія 9.1, SAS Institute, Cary, NC) використовували для всіх статистичних аналізів. Ми виключили трьох кемперів за неповними даними (вони мали ранкові ранкові рейси і виїжджали з містечка перед тим, як відвідати GCRC для вимірювання та забору крові), давши остаточний розмір вибірки n = 22. Для кожного з усіх трьох методів всі зразки були протестовані у двох примірниках, і було використано середнє значення. Для порівняння трьох методів ми обчислюємо різницю середніх значень найменших квадратів (PROC MIXED в SAS) і створюємо графіки різниці Бленда-Альтмана. 15 P 2 (Таблиця 1). Сім кемпінгів класифікували як осіб із надмірною вагою або ожирінням (ІМТ ≥ 25 кг/м 2). Після прибуття до табору середнє споживання енергії та білків становило 1674 ккал/день та 59 г/день, а споживання Phe та Tyr - 9,9 та 82,4 мг/кг/день, відповідно.

Повний розмір таблиці

Найбільша середня різниця середніх квадратів при порівнянні трьох методів була між ААА та МС/МС, середні концентрації ААА Phe приблизно на 137 мкМ були вищими за МС/МС (табл. 2). Результати AAA також були значно вищими, ніж результати, отримані за допомогою ВЕРХ (102 мкМ). Істотних відмінностей середніх концентрацій Phe, проаналізованих за допомогою ВЕРХ та MS/MS, не виявлено.

Повний розмір таблиці

На наших цифрах Бленда-Альтмана ми будуємо графік процентної різниці концентрацій Phe проти середніх концентрацій Phe. Концентрації Phe, отримані від AAA, були в середньому на 12% вищими, ніж концентрації, отримані від ВЕРХ (рис. 1); виявляється менша різниця при менших концентраціях Phe. Концентрації Phe, отримані від AAA, були в середньому на 19% вищими, ніж концентрації, отримані від MS/MS (рис. 2). Хоча не було суттєвих відмінностей у концентраціях Phe, отриманих за допомогою ВЕРХ та MS/MS, графік різниці показує, що в середньому вимірювання були приблизно на 5% вищими для ВЕРХ (рис. 3). З рисунка випливає, що будь-яка різниця дещо більша при менших концентраціях Phe.

Графік Бленда-Альтмана щодо процентної різниці концентрації фенілаланіну (аналізатор амінокислот - високоефективна рідинна хроматографія) порівняно із середньою концентрацією фенілаланіну, визначеною двома методами. Середня різниця у відсотках позначається суцільною лінією, а межі 95% - пунктирними лініями.

Повнорозмірне зображення

Графік Бленда-Альтмана щодо процентної різниці в концентрації фенілаланіну (аналізатор амінокислот - тандемна мас-спектрометрія) проти середньої концентрації фенілаланіну, визначеної двома методами. Середня різниця у відсотках позначається суцільною лінією, а межі 95% - пунктирними лініями.

Повнорозмірне зображення

Графік Бленда-Альтмана щодо процентної різниці в концентрації фенілаланіну (високоефективна рідинна хроматографія - тандемна мас-спектрометрія) порівняно із середньою концентрацією фенілаланіну, визначеною двома методами. Середня різниця у відсотках позначається суцільною лінією, а межі 95% - пунктирними лініями.

Повнорозмірне зображення

ОБГОВОРЕННЯ

Ми виявили суттєві відмінності в концентраціях Phe у крові, виміряних AAA, HPLC та MS/MS. Аналіз AAA у плазмі дав найвищі показники концентрації Phe у крові; ВЕРХ та МС/МС, в яких використовували зразки крові з фільтрувального паперу, статистично не відрізнялись між собою, а концентрації Phe були постійно на 12% нижчими для ВЕРХ та 19% нижчими для РС/МС порівняно з ААА. Концентрації Phe в крові, отримані за допомогою трьох методів, досить відрізняються, щоб мати реальний клінічний вплив, оскільки різні значення, швидше за все, спричинять різні коригування дієти або метаболічних продуктів з боку лікаря або дієтолога з метаболізму, особливо при більш високих концентраціях Phe.

У цьому аналізі ми порівнюємо три методи з використанням зразків крові (плазми або фільтрувального паперу), підготовлених та проаналізованих, як це робиться для контролю концентрації Phe у наших лабораторіях; Ми не порівнювали аналіз плазми та цільної крові на фільтрувальному папері для того самого методу. Крім того, наші зразки крові з фільтрувального паперу були виявлені за зразком венозної крові, взятим у кожного кемпера, а не за відбитками пальців; отже, ці зразки не є повною мірою репрезентативними для тих, які були б надіслані нам для рутинного моніторингу. Ми вирішили використовувати венозні зразки лише для того, щоб уникнути непотрібного напруження наших кемперів від зайвих паличок, а також для забезпечення повного і послідовного насичення фільтрувального паперу кров’ю.

Наш аналіз був підсилений порівняно великою вибіркою дівчат та жінок із ФКУ, у яких відбирали зразки крові натще і безпосередньо спостерігали на фільтрувальному папері у два моменти часу флеботомами, які пройшли навчання в Загальному клінічному дослідницькому центрі. Наші результати підкреслюють необхідність того, щоб ті, хто бере участь у моніторингу концентрацій Phe, були настільки ж обізнані з використовуваною методологією, як і отримані результати. Потрібні додаткові дослідження для порівняння кількісного визначення концентрацій Phe у плазмі та цільної крові на фільтрувальному папері із застосуванням цих різних методологій; Краще розуміння відмінностей в аналітичних методах моніторингу Phe є важливим для розробки рекомендацій для лікарів та дієтологів з метаболізму, що працюють з пацієнтами ФКУ.