Анотація

Передсердний натрійуретичний пептид (АНП) є важливим компонентом натрійуретичної пептидної системи. Тучні клітини відіграють головну роль у багатьох регуляторних системах. Тим часом участь цих клітин у діяльності АНП недостатньо вивчена. У цій роботі ми продемонстрували присутність ANP в очеревинних тучних клітинах щурів. Чисту фракцію тучних клітин отримували шляхом поділу клітин очеревини щурів за градієнтом щільності Percoll. У лізатах із цих тучних клітин методом Вестерн-блот виявлено два ANP-імунореактивні білки з молекулярною масою 2,5 кДа та 16,9 кДа. Електронно-мікроскопічне маркування імунозолото виявило наявність ANP-імунореактивного матеріалу при зберіганні, секреції та виділенні гранул тучних клітин. Отримані нами дані дозволяють припустити, що тучні клітини очеревини щурів містять як гормон ANP, так і ANP. Ці два пептиди розташовані в гранулах секреторних клітин тучних клітин і виділяються за допомогою механізму дегрануляції. Обговорюється, що багато функцій тучних клітин можуть бути зумовлені виробленням цими клітинами натрійуретичних пептидів.

Передсердний натрійуретичний пептид (АНП) - гормон з діуретичними, натрійуретичними та судинорозширювальними властивостями. Цей пептид продукується головним чином передсердними кардіоміоцитами 1. На секрецію АНП кардіоміоцитами свідчить наявність у цих клітинах специфічних секреторних везикул, так званих передсердних гранул. Вміст передсердних гранул виділяється через перевантаження, нестачу кисню та багато інших фізіологічних та патологічних процесів у міокарді. ANP також виробляється фібробластами овець, які проникають в інфаркт міокарда 2, клітинами провідної системи щурів та бичачих систем 4, нейронами головного мозку щурів 5, клітинами тимусу 6 щурів, клітинами рогівки великої рогатої худоби 7, клітинами гладких м’язів щурів 8 та макрофагами миші 9. .

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Ізоляція тучних клітин

Фракцію чистого тучного клітини виділяли із суспензії перитонеальних клітин щурів шляхом поділу клітин на градієнт щільності Перколла, як описано в детальному протоколі 14. Було використано шість дорослих щурів Wistar вагою 250-300 г. Після ефірної анестезії та обезголовлення в порожнину очеревини тварини вводили 10 мл PBS; під час ніжного масажу живота розкрили очеревину порожнину та зібрали промивання клітин за допомогою піпетки Пастера. Змиви від 6 щурів центрифугували при 120 х g протягом 10 хвилин, гранулу ресуспендували в 0,5 мл PBS і отриману суспензію клітин шарували на 88% градієнті Percoll. Градієнт Percoll отримували додаванням 0,7 мл 10-кратного концентрованого RPMI (Gibco BRL) до 200 мМ Hepes/1M NaOH, рН 7,0 і центрифугуванням при 17000 х g протягом 20 хвилин. Попередньо сформований градієнт Percoll із суспензією клітин, нашаруваною зверху, центрифугували при 450 х g протягом 15 хвилин. Фракцію тучних клітин, яка зараз займала дно пробірки, збирали і двічі промивали в PBS. Зразки електронної мікроскопії клітинної суспензії відбирали до (зразок 1) та після поділу (зразок 2) у Percoll. Ізольовані клітини вивчали за допомогою Вестерн-блот-аналізу та електронної мікроскопії імуноцитохімії.

Вестерн-блот-аналіз

Очищені тучні клітини лізували в буферному розчині з таким складом (мМ): 10 х Трис-HCl, рН 7, 4, 150 NaCl, 0,5% нонідет-Р40, 0,2 апротиніну, 0,2 лейпептину, 1 Na-ортованадат, натрій 1 -фтор. 0,2 фенілметилсульфонілфториду та 20% гліцерину. Білки лізату відокремлювали 20% -ним електрофорезом у поліакриламідному гелі SDS і переносили на нітроцелюлозну мембрану 16. Виявлення ANP-імунореактивних білків проводили за допомогою первинного поліклонального антитіла кролячого щура, синтетичного C-кінцевого ANP (амінокислоти 99-126, Peninsula Lab. Inc., Bachem), розведеного 1: 1000, та вторинного антитіла хрону, кон'югованого з пероксидазою хрону на IgG миші (Сігма). Білки на імуноблотах виявляли методом підвищеної хемілюмінесценції. Комерційний щур ANP (Sigma) служив контролем. Для калібрування використовували набір для молекулярних ваг від 2,5 до 17 кДа (Sigma).

Імуноцитохімія електронного мікроскопа

Були використані наступні антитіла: те саме первинне антитіло, що і для вестерн-блот, розведене 1: 1000 та кон'югований (10 нм) білок А (Sigma), розведений 1:20 як вторинне антитіло.

Клітини фіксували 2,5% глутаральдегідом в 0,1 М натрій-какодилатному буфері, рН 7,4, протягом 1 години, після фіксації 1% OsO 4, фарбували в блоці уранілацетатом, зневоднювали і поміщали в Epon-Araldit згідно зі стандартною процедурою. Ультратонкі зрізи вирізали алмазним ножем і встановлювали на нікелеві сітки. Сітки для нарізки обробляли в H 2 O 2, а потім інкубували протягом ночі при 4 ° C з первинним антитілом з наступною інкубацією протягом 1 години при кімнатній температурі з вторинним антитілом. Препарати фарбували уранілацетатом та цитратом свинцю та досліджували під електронним мікроскопом JEM 7A при 80 кВ. Специфічність імунофарбування оцінювали за допомогою наступного контролю: опускаючи первинну стадію антисироватки та застосовуючи лише вторинне антитіло. Контроль дав негативні результати, тобто незначні випадкові відкладення частинок золота на зрізах. Частка тучних клітин у зразках 1 і 2 розраховували за допомогою світлового мікроскопа на зрізах пилку, забарвлених метиленовим синім. Для кожної проби аналізували 300 клітин.

РЕЗУЛЬТАТИ

перитонеальних

Світлові клітини (стрілки), серед інших клітин, населяли очеревинну порожнину щура (зразок 1 перед фракціонуванням у Перколлі). Семітинова частина забарвлена ​​метиленовим синім. Стовпчик = 5 мкм.

Повнорозмірне зображення

Тучні клітини після виділення в Percoll (зразок 2), зріз семітину, пофарбований метиленовим синім. Стрижень = 5 мкм.

Повнорозмірне зображення

Електронна мікрофотографія тучних клітин у стані дегрануляції. У клітині між гранулами для зберігання з однорідним матеріалом спостерігаються вивантаження гранул з дезорганізованою матрицею та виділеними гранулами (r) поблизу поверхні клітини. N, серцевина. Стрижень = 1 мкм.

Повнорозмірне зображення

Вестерн-блот-аналіз

Ідентифікація ANP-імунореактивних білків у перитонеальному лізаті тучних клітин (рис. 4) показує наявність двох білків, розпізнаних антитілом у С-кінцевій частині ANP. Ці білки мали молекулярну масу приблизно 2,5 кДа та 16,9 кДа. Положення білка з меншою вагою відповідало положенню ANP контрольної щури.

Вестерн-блоттінг перитонеальних тучних клітин щурів (лінія А) та синтетичного пептиду ANP щурів (лінія В) реагував із анти-щурячими анти-щурячими антитілами ANP (99-126) після поділу SDS за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. Дві смуги - 2,5 кДа і 16,9 кДа вказують на наявність зрілого ANP і proANP.

Повнорозмірне зображення

Імуноцитохімія електронного мікроскопа

Внутрішньоклітинна локалізація ANP-імунореактивного матеріалу була продемонстрована на рівні електронного мікроскопа шляхом маркування імунозолотою. Встановлено, що імунофарбування обмежується секреторними гранулами тучних клітин як першого, так і другого зразків. Було вказано зберігання (рис. 5) та виведення (рис. 6) гранул, а також гранул, що лежать близько до поверхні тучних клітин (рис. 7). Не виявлено локалізації частинок імунозолотого над цитозолем або будь-якими органелами тучних клітин, крім гранул. Гранули еозинофілів також були слабо імунореактивними в ультратонких зрізах клітин першого зразка (рис. 8). Центральну частину еозинофільних гранул займали кристалоїдні електрони щільної структури. Знак розміщували однаково на всіх компонентах гранул. В інших клітинах відповіді не спостерігалося. Контрольні препарати (без первинного лікування антитілами) показали негативний результат.

Імуноелектронна мікрофотографія, що показує наявність ANP-імунореактивного матеріалу в гранулах для зберігання тучних клітин. Ті самі золоті частинки позначені стрілками. Стрижень = 0,2 мкм.

Повнорозмірне зображення

ANP-позитивний імунозабарвлення у виділених гранулах тучних клітин. Ті самі золоті частинки позначені стрілками. Стрижень = 0,2 мкм.

Повнорозмірне зображення

Позначення ANP у виділених гранулах тучних клітин. Ті самі золоті частинки позначені стрілками. Стрижень = 0,2 мкм.

Повнорозмірне зображення

Гранули еозинофілу слабко імуномічені щодо АНП. Стрілки позначають частинки золота, що осідають на гранулах. Стрижень = 0,5 мкм.

Повнорозмірне зображення

ОБГОВОРЕННЯ

Після фракціонування в градієнті Перколла суспензія клітин складалася з 98% тучних клітин. Чистота цієї популяції є гарантією того, що ІМП-імунореактивний матеріал, виявлений вестерн-блот, походить з тучних клітин. Відомо, що ANP є високомолекулярним попередником, проатріальним натрійуретичним пептидом (proANP), що складається з 126 амінокислотних залишків. С-кінцевий фрагмент цієї молекули являє собою зрілу форму ANP (99-126), яка є результатом розщеплення прогормону (див. Опитування 17). Однак нерозщеплений proANP також виділяється в кров і циркулює зі зрілим ANP18. Присутність proANP (1-126, 16, 9 кДа), але не зрілого АНП (99-126, 2, 5 кДа) було показано в екстрактах тканин передсердь щурів 3. Ми виявили наявність двох ANP-імунореактивних білків у тучних клітинах очеревини щурів. Один мав ту саму молекулярну масу, що і зрілий ANP-2,5 кДа, тоді як інший білок мав молекулярну масу 16,9 кДа, що відповідає повній масі proANP щурів. Таким чином, наші дані свідчать про те, що перитонеальні тучні клітини щурів містять як зрілий АНП, так і його попередник.

Імуноцитохімія електронного мікроскопа показала, що ANP-імунореактивний матеріал присутній у гранулах тучних клітин. Наявність міченого матеріалу в гранулах для зберігання, виведення та вивільнення свідчить про те, що секреція АНП з тучних клітин відбувається за класичним механізмом дегрануляції.

Широке поширення тучних клітин в організмі може спричинити виявлення АНП майже у всіх тканинах хребетних 19. Багато біологічних функцій тучних клітин, таких як імунорегуляційний потенціал 20, протипухлинний ефект 21 та інші, можуть бути зумовлені їх утворенням АНП.

Важливою особливістю тучних клітин є їх здатність виробляти передавачі, які мають протилежний вплив на той самий процес. Наприклад, тучні клітини виробляють як гістамін, який має протизапальну дію, так і гепарин, який має протизапальну дію. Нещодавно було показано, що тучні клітини серця щурів та клітини HMC-1 (лінія тучних клітин людини) містять ренін, активатор системи ренін-ангіотензин-альдостерон 22, та природний антагоніст ANP 23, 24. На відміну від діуретичного АНП, ренін чинить антидіуретичну дію. Висловлено думку, що серцево-судинний гомеостаз підтримується балансом між натрійуретичною пептидною системою та ренін-ангіотензин-альдостероновою системою 25. Таким чином, виділяючи певну кількість реніну та/або ANP, тучні клітини можуть ефективно регулювати цей баланс.

Тучні клітини очеревини відіграють важливу роль у патологічних процесах живота. Тому вони виконують захисну функцію в патогенезі септичного перитоніту 26. Також було показано, що операція на животі викликає дегрануляцію тучних клітин і збільшує фактори, що походять від тучних клітин, у перитонеальній рідині 27. Присутність ANP, виявленого в очеревинних тучних клітинах, може, з одного боку, пояснити багато відомих функцій цих клітин, а з іншого боку, передбачити деякі з їх ще не вивчених біологічних ефектів, що розширюють функціональний діапазон тучних клітин. Встановлено, що тучні клітини очеревини щурів вивільняють гістамін (прозапальний фактор) у відповідь на ефект ANP 28, 29. Можна припустити, що під час внутрішньочеревного запалення цей процес відбувається в аутокринному режимі через вивільнення АНП з активованих тучних клітин. Цікаво, що АНП також зменшує секрецію медіаторів запалення в макрофагах і тому має протизапальний потенціал 30. Ці дані знову показують функціональний дуалізм тучних клітин. Через біологічний ефект, отриманий від тучних клітин АНП може мати велике значення для регулювання фізіологічного стану органів черевної порожнини. Наприклад, повідомляється, що ANP впливає на функцію яєчників у мишей 31 .

Присутність ANP-імунореактивного матеріалу в еозинофільних гранулах, що було виявлено в нашій роботі, може бути пов'язано з продукуванням цього пептиду цими еозинофілами та/або їх поглинанням ANP, що виділяється іншими клітинами, ймовірно, тучними клітинами. Ця остання пропозиція підтверджується даними, які показують, що еозинофіли здатні поглинати вивільнені гранульовані продукти тучних клітин 32 .

Дякую

Ми дуже вдячні доктору Леонід З ПЕВЗНЕР за виправлення англійського тексту. Ця робота частково підтримана Російським фондом фундаментальних досліджень (грант 05-04-49393).