предметів

реферат

Кон'югати антитіло-лікарські засоби (АЦП) або імунокон'югати виявились новим класом препаратів для цілеспрямованої терапії раку 1, 2. АЦП - це трикомпонентна система, в якій терапевтичне моноклональне антитіло (mAb) та потужний цитотоксичний лікарський засіб з невеликими молекулами кон’югують через стабільний лінкер. MAb спеціально розпізнає поверхневий антиген/рецептор на ракових клітинах, які блокують передачу сигналу. Тим часом комплекс ADC інтерналізується в ракові клітини, де антитіло розкладається, а цитотоксичний препарат вивільняється. Ця унікальна конструкція не тільки значно зменшує побічні ефекти цитотоксичних препаратів, але й дозволяє збагачувати цитотоксичні препарати в ракових клітинах 3. Два АЦП, брентуксимаб ведотин та адотрастузумаб емтанзин, були схвалені FDA для лікування лімфоми та раку молочної залози 1. В даний час багато препаратів ADC перебувають у клінічних випробуваннях для лікування раку 4 .

Ми були зачаровані дизайном АЦП, ми запитали, чи можна використовувати подібну стратегію для лікування ожиріння, націлюючи метаболічні органи. Оскільки немає встановлених антитіл, придатних для розробки АЦП, ми звернулися до антисмислових олігонуклеотидів (ASO) як потенційної заміни антитілам. ASO - це модифіковані короткі одноланцюгові молекули ДНК, які регулюють експресію генів переважно в печінці та жирі 5, 6, 7. АСО мають дуже низьку біодоступність у скелетних та серцевих м’язах, мозку, підшлунковій залозі після системного введення 6, 7, 8. Насправді докладено значних зусиль для розробки модифікацій ASO для поліпшення проникнення в інші органи, крім печінки та жиру 9. Це обмеження ASO на лікування неврологічних, м'язових та серцевих захворювань виявляється вигідним при розробці кон'югатів ASO-препарат для цільового жиру та печінки для лікування ожиріння. Іншим важливим фактором при виборі АСО є те, що, як і клітинне поглинання АЦП, було показано, що інтерналізація АСО відбувається в основному через ендоцитоз 10, 11 .

Збільшення енергетичних витрат є основною стратегією лікування ожиріння. Гормон щитовидної залози Т3 дуже потужний у збільшенні основного обміну речовин та індукуванні побуріння жирової тканини 12, 13. Втрата ваги є основним симптомом гіпертиреозу у людей14. Однак гормон щитовидної залози протипоказаний для лікування ожиріння через системний вплив на мозок, серце та м’язи, що спричиняє тривогу, серцеву недостатність та втрату м’язів 14. Оскільки АСО дуже погано проникають у ці органи, ми припускаємо, що кон'югати АСО-Т3 мінімізують вплив гормонів щитовидної залози на ці органи.

Інше питання полягає в тому, який лінкер використовувати для кон’югації ASO та T3. Ми вибрали сульфосукцинімідил 4- (N-малеімідометил) циклогексан-1-карбоксилат (Sulfo-SMCC), нерозщеплюваний і непроникний для мембрани зшивач завдяки своїй високій селективності, кінетиці швидкої реакції та сумісності з водними умовами реакції., Sulfo-SMCC містить амінореактивний N-гідроксисукцінімід (складний ефір NHS) та сульфгідрильну реакційноздатну малеїмідну групу. Сульфо-SMCC-малеїмідна група є надзвичайно стабільною завдяки циклогексановому мосту в розпірному плечі. Це значно підвищує стійкість АЦП препарату до обігу. Sulfo-SMCC широко використовується у синтезі АЦП, включаючи схвалений FDA адастрастузумаб емтанзин.

Потім ми протестували два встановлені ASO. Нікотинамід N-метилтрансфераза (NNMT) є модулятором метилювання гістону, який регулює витрату клітинної енергії в жировій тканині 16, 17. Лікування NNMT-ASO запобігає ожирінню, спричиненому дієтою 16. Затверджений FDA препарат Міпомерсен є ASO проти аполіпопротеїну В (ApoB) для лікування відомої гіперхолестеринемії 5. Використовуючи концепцію дизайну ADC, ми синтезували нові сполуки шляхом хімічного кон’югування NNMT-ASO та ApoB-ASO з гормоном Т3 за допомогою сульфо-SMCC-лінкера. Потім ми досліджували вплив біокон’югатів ASO-T3 на ожиріння.

результат

Синтез та функції ASO-T3

Гормон щитовидної залози Т3 спочатку реагував із сульфо-SMCC, утворюючи активований малеїмідом Т3. Потім продукт кон'югували з фосфоротіоатом, модифікованим NNMT-ASO або ApoB-ASO (рис. 1а). У продуктах NNMT-ASO-T3 (NAT3) та ApoB-ASO-T3 (AAT3) відсутні виявлені вільні T3 або T3-SMCC (додатковий малюнок 1a-d). Успішне кон'югування ASO і T3 було перевірено за допомогою MALDI-TOF MS (Додаткова фігура 2a, b). Потім ми дослідили, чи можуть кон'югати ASO-T3 зберігати функціональність ASO і T3. Репортер активував рецептори гормонів щитовидної залози NAT3 та AAT3 (рис. 1b, в). Ефекти послаблювались обробкою хлорохіном, інгібітором закислення лізосом, що свідчить про те, що лізосома відіграє важливу роль у активності T3 NAT3 та AAT3 (рис. 1b, в). Активність ASO у кон’югатах ASO-T3, як видається, залежить від цілі. AAT3 зменшив експресію ApoB до подібного ступеня, як ApoB-ASO (AA) у культивованих гепатоцитах (рис. 1г), тоді як NAT3 не зміг придушити експресію NNMT у культивованих гепатоцитах, адипоцитах (не показано) або жировій тканині (рис. 1д). Оскільки NAT3 не має активності NNMT-ASO, і відомо, що ApoB-ASO не впливає на масу тіла тварин і людей 18, 19, ми зосередилися на вивченні впливу AAT3 і NAT3 на витрати енергії та втрату ваги.

наукові

Вплив ASO-T3 на експресію генів в метаболічних органах. ( a, b ) Маркери Браунінга (Ucp1, Pgcla, Cidea, Cox7a1 та Cox8b) у паховій білій жировій тканині (iWAT). ( c ) Експресія Ucp1 в епідидимальній білій жировій тканині (eWAT). ( d ) Експресія сімейства з 6 носіїв 6 розчиненого носія (Scl6a8), гліцину амідинотрансферази (Gamt) та мітохондрій креатинкінази 2 (Ckmt2) в eWAT. ( e ) Експресія генних маркерів коричневої жирової тканини (BAT). ( f ) Експресія печінкового гормону щитовидної залози (Dio1) та холестерину 7альфа-гідроксилази (Cyp7a1), реагуючого на ген деодинази-1. ( g ) Глюконеогенні гени (G6pase, Pepck) та гени синтезу жирних кислот (Acc1, Acc2 та Fas) у печінці. ( h, i ) Вираз Mhc-b ( h ) та Mhc-a та тропонін (Trop) ( i ) в серці. ( j ) Експресія Serca1 та Searca2a в м’язах. NAT3: NNMT-ASO-T3; AAT3: ApoB-ASO-T3. n = 4-6 на групу; * p § p = 0,07 проти контролю, # p

Вплив ApoB-ASO-T3 (AAT3) на рівень ЛПНЩ. ( a ) Рівні мРНК аполіпопротеїну В (ApoB) печінки. b ) Рівень ЛПНЩ у сироватці крові. AA: ApoB-ASO. n = 5-6 на групу; * p # p 25. Багато ліків, такі як гормони щитовидної залози та агоністи адренергічних рецепторів, досить сильно сприяють збільшенню витрат енергії 26, 27, 28. Однак системна дія цих препаратів забороняє їх використання при лікуванні ожиріння. Ситуація схожа на цитотоксичний препарат для лікування раку. Хоча цитотоксичні препарати ефективно знищують ракові клітини, вони також значно пошкоджують нормальні тканини. Мистецтво розробки ліків АЦП приносить терапевтичну революцію в лікуванні раку, забезпечуючи цілеспрямовану доставку цитотоксичних препаратів до ракових клітин. Використовуючи концепцію дизайну АЦП та користуючись перевагами жирового та печінкового націлювання ASO, ми успішно розробили кон’югати ASO-T3. Нещодавно повідомлялося, що гібридний кон’югаційний глюкагон-Т3 селективно націлений на жирову тканину та печінку, що призводить до значної втрати ваги та поліпшення метаболічного синдрому у мишей із ожирінням 29. Тому нова конструкція ліків для індукування гіпертиреозу жиру та печінки може призвести до нового напрямку у розробці ліків для лікування ожиріння та метаболічного синдрому.

Ідеальним результатом конструкції ASO-T3 є підтримка активності ASO і T3, щоб ASO могла згортати цільовий ген, а T3 активувати рецептори гормонів щитовидної залози в жирах і печінці. Метою є досягнення синергетичних ефектів ASO та T3 на поліпшення глюкозного, ліпідного та енергетичного обміну. Однак кон'югація малих молекул з ASO може впливати на стабільність та активність ASO 29, 30. Для двох тестованих кон’югатів ASO-T3 лише ApoB-ASO-T3 зберігає активність ASO, тоді як NNMT-ASO-T3 не може скинути NNMT. Тому ретельний відбір та тестування ASO важливий для успішного кон’югування ASO-T3.

Хоча як T3, так і ASO-T3 збільшують енергетичні витрати, лише миші, оброблені ASO-T3, демонструють знижену масу тіла та ожиріння. На відміну від схуднення у людей з гіпертиреозом, миші, які отримують еутиреоз, що отримують лікування Т3, систематично не втрачають, а набирають вагу. Це багато в чому пов’язано з прямим впливом Т3 на гіпоталамус на стимулювання споживання їжі та впливом на кишечник для збільшення поглинання поживних речовин у мишей 20, 21, 22. Незважаючи на подвійне годування, витрата та поглинання енергії у мишей, оброблених Т3, здається збалансованими. Однак циркулюючий Т3 не збільшується у мишей, оброблених ASO-T3. Таким чином, відсутність системного ефекту Т3 для компенсації збільшених витрат енергії, що призводить до втрати ваги та зменшення ожиріння.

Одним із важливих міркувань щодо використання ASO як вектора самонаведення тканини є те, що антитілоподібні ASO в ADC інтерналізуються в клітини тканини шляхом ендоцитозу in vivo 10, 11 (рис. 4c). Фізіологічний процес ендоцитозу не пошкоджує цілісність клітинної плазматичної мембрани і, отже, менш токсичний. Внутрішньоклітинно АСО або деградуються безпосередньо в лізосомах, або гібридизуються до РНК і деградують нуклеазами 10, 31, 32. Інгібування підкислення лізосом хлорохіном зменшилось, але не повністю відмінило активність Т3 (рис. Lb, в), що припускає, що обидва шляхи можуть брати участь у дисоціації ASO і Т3 у культивованих клітинах.

Підводячи підсумок, використовуючи принцип ADC, ми успішно розробили кон'югати ASO-T3 і продемонстрували, що ASO-T3 може представляти нову стратегію розробки ліків для лікування ожиріння. Важливо, що ApoB-ASO (Mipomersen) - це препарат, затверджений FDA, із встановленими профілями безпеки для лікування відомої гіперхолестеринемії. Кон'югат ApoB-ASO-T3 може потенційно застосовуватися у пацієнтів із загальним ожирінням з гіперхолестеринемією.

Матеріали і методи

Синтез ASO-T3

Модифікований фосфоротіоатом ASO 16, 19 (мишачий NNMT-ASO: 5-GAAATGAACCAGCAGGCCTT-3 та миша ApoB-ASO: 5-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3) з 5'-тіолом та амінолінкером C6 синтезували за допомогою Bio-Synthesis (Lew) ). ). Гормон щитовидної залози Т3 спочатку реагував із сульфо-SMCC, утворюючи активований малеїмідом Т3. Після очищення високоефективною рідинною хроматографією з зворотною фазою (RP-HPLC) надлишок T3-SMCC реагує з функціонованими тіолом олігонуклеотидами з утворенням кон'югатів ASO-T3. Кон'югати очищали за допомогою RP-HPLC і характеризували MALDI-TOF MS.

Активність рецепторів гормону щитовидної залози

Клітини HEK293T утримувались у модифікованому Дульбекко середовищі Eagle, доповненому L-глутаміном, 10% -ною фетальною телячою сироваткою плоду, пеніциліном та стрептоміцином. Перехідні трансфекції проводили в 6-лункових планшетах субконфлюентних клітин. Виконували двоступеневу трансфекцію, оскільки ніякої активності люциферази не можна було виміряти при котрансфекції плазмід ASO (не показано). Плазміди, включаючи рецептор гормону щитовидної залози альфа (100 нг), бета-рецептор гормону щитовидної залози (100 нг), рецептор гормону щитовидної залози DR4-люцифераза (100 нг) і PRL-TK (10 нг) були вперше трансфіковані в клітини HEK293T за допомогою реагенту для трансфекції FuGENE. HD (Рош) 40. Через дванадцять годин клітини трансфікували ASO-T3 (1 мкМ). Активність люциферази вимірювали через 36 годин після трансфекції ASO-T3. Індукована люциферазою активність люциферази DR4 нормалізувалась до активності люциферази Renla, керованої PRL-TK. Хлорохін (100 мкМ) додавали для інгібування підкислення лізосом за 6 годин до вимірювання активності люциферази. Т3 (1 нМ) додавали за 24 години до збору клітин для позитивного контролю активності репортерів гормонів щитовидної залози.

Лікування ASO-T3 у мишей

Мишей дикого типу C57BL/6 було придбано в лабораторії Джексона і поміщено в 12-годинний цикл світло/темрява (світиться з 7:00 до 19:00). Спочатку мишей лікували дієтою з високим вмістом жиру (Research Diets D12331, 5, 56 ккал/г) протягом 12 тижнів. Для базового складу тіла було проведено МРТ. Потім мишей обробляли контролем PBS, T3 (200 мкг/кг) або ASO-T3 (25 мг/кг) двічі на тиждень. Дослідження метаболічних клітин розпочали з 7-го дня, коли не було різниці у масі тіла. Повторну МРТ проводили через три тижні після лікування. Дослідження на мишах проводились відповідно до федеральних настанов і були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Каліфорнійському університеті Ірвін та Університеті Східної Кароліни.

Вимірювання сироватки Т3

Сироватку Т3 вимірювали за допомогою рідинної хроматографії та тандемної мас-спектрометрії (LC-MS/MS) 41, 42. Вісімдесят мікролітрів сироватки від мишей, оброблених Т3 або АСО-Т3 протягом двох годин, змішували з аскорбіновою кислотою, лимонною кислотою та дитиотрейтолом (25 мкг/мкл) для запобігання потенційним перетворенням гормонів щитовидної залози. Після однієї години інкубації на льоду додавали 640 мкл сечовини і розчин інкубували протягом години при 50 ° C. Зразки потім піддавали екстракції твердої фази перед ін'єкцією в LC-MS/MS. Поділ досягали за допомогою GP-фенілу (3 мкм, 2,1 х 100 мм). Градієнт рухомої фази складався з 0,1% мурашиної кислоти у воді (А) та ацетонітрилу (В) і швидкість потоку регулювали до 0,2 мл/хв. Виявлення мас-спектрометрії проводили на триступеневому триступеневому мас-спектрометрі TSQ Vantage, напруга розпилення: 3,2 КВ, температура випарника: 200 ° C, тиск газу в сорочці: 45 арб, тиск газу Aux: 15 арб, температура капілярів: 270 ° C. Кількісну оцінку проводили шляхом моніторингу вибраних реакцій (SRM) в режимі позитивної іонізації, і параметри становлять m/z 651, 517 → 508.000 для T3 (CE 22 еВ; S-лінза при 161 V), 461, 095 → 285, 056 для IS (CE 19 еВ, S-лінза при 88 В).

Статура

Склад тіла аналізували у мишей, які отримували контрольний PBS, T3, NNMT-ASO-T3 або ApoB-ASO-T3 протягом 3 тижнів, використовуючи прилад EchoMRI 3-в-1 (Echo Medical Systems, Houston, TX).

Метаболічні клітини

Витрати енергії оцінювали за допомогою системи TSE PhenoMaster. Годували HFD мишей обробляли контролем PBS, T3, NNMT-ASO-T3 або ApoB-ASO-T3 протягом 7 днів. Мишей акліматизували в метаболічних клітинах за 2 дні до експериментів. Виробництво CO2 та споживання O2 збирали кожні 60 хвилин для кожної миші протягом 3 - 4 днів. Рівні були нормалізовані до м’якої маси. Споживання їжі та активність вимірювались через рівні проміжки часу.

Вимірювання рівня глюкози, інсуліну та ЛПНЩ у сироватці крові

Рівні глюкози вимірювали за допомогою колориметричного аналізу глюкози (Cayman Chemicals). Інсулін вимірювали за допомогою набору надчутливого інсуліну ELISA (Crystal Chem). LDL вимірюється за допомогою набору для аналізу LDL від BioAssay Systems.

Вилучення РНК та кількісна ПЛР

Жирову тканину та РНК з печінки витягували за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen). РНК із серця та м’язів отримували за допомогою набору RNeasy Fibrous Tissue Mini (Qiagen). Клітини гепатоми миші Hepa1-6 трансфікували ASO та ASO-T3. РНК екстрагували через 48 годин після трансфекції. ПЛР SYBR в реальному часі проводили, як описано вище 43. Праймери наведені в Додатковій таблиці-1.

Статистичний тест

Всі дані виражаються як середнє значення ± sem Аналізи розсіювання проводились з подальшим тестом Бонферроні-Холма для багаторазового порівняння. Статистичне значення для с