предметів

реферат

Основним завданням при розробці профілактичних вакцин проти раку є визначення імуногенних та безпечних антигенів проти раку. Через сильну подібність моделей експресії антигену між раком та ембріональними тканинами, ми визначили прототип стратегії використання білка теплового шоку gp96, отриманого з плаценти, який індукує Т-клітинні профілактичні реакції проти пухлин. Імунізація плацентарним gp96 забезпечувала частковий захист та довготривалий (принаймні 3 місяці) протипухлинний імунітет проти росту трансплантаційної меланоми або пухлин молочної залози у мишей, викликаючи повний захист від 7,12-диметилбенз (а) -антрацену (DMBA). індуковані пухлини молочної залози у щурів та суттєво знизили частоту та ріст аутохтонних пухлин молочної залози у трансгенних мишей HER2. Плацентарний gp96 активував відповіді на HER2 та MUC1-специфічні Т-клітини шляхом зв'язування з асоційованими з пухлиною антигенами. Наші результати показують нову імуногенність плацентарного gp96 та його потенційне використання як багатовалентної вакцини проти раку.

Незважаючи на значний прогрес у розумінні причин раку та значний прогрес у лікуванні раку за останні роки, хвороба зберігається, і захворюваність на рак зростає у всьому світі 1. На відміну від високоефективних профілактичних вакцин проти інфекційних захворювань, терапевтичні вакцини проти раку, які не викликають неприйнятних аутоімунних розладів, не були настільки ефективними, виробляючи лише додаткові терапевтичні ефекти 2. Найпростішим поясненням може бути те, що використання терапевтичних вакцин для лікування встановлених пухлин еквівалентно невдалому підходу до використання вакцин проти вірусу гепатиту В (ВГВ) або вірусу папіломи людини (ВПЛ) для лікування хронічної ВГВ або ВПЛ-інфекції. Повідомлялося, що кілька механізмів зворотного розвитку включають витікання та придушення імунної системи, мабуть, через тривалий розвиток, початок та ріст пухлини, включаючи порушення реакцій Т-клітин, імунну толерантність та супресивне мікросередовище пухлини, яке може діяти . синергетично 3. Це підкреслює необхідність розробки профілактичного підходу до вакцини проти раку, який забезпечить дешеву та високоефективну раціоналізацію.

Основною проблемою при розробці профілактичних вакцин проти раку є визначення імуногенних та безпечних антигенів проти раку, які можуть служити мішенями для ефективних вакцин, включаючи специфічні до пухлини антигени та білки, надмірно експресовані на пухлині, але не на нормальних тканинах. На сьогоднішній день виявлено лише обмежену кількість антигенів раку з кількома успіхами 4, 5, 6. Добре задокументовано, що більшість типів солідних пухлин різним чином експресують ембріональні антигени, і існує сильна подібність у експресії антигену між раком та ембріональними тканинами, що забезпечує потенціал націлювання на ембріональні компоненти як ефективну стратегію профілактики раку 7. Вакцинація антигенами ембріональних або стовбурових клітин призводить до сильної захисної імунної відповіді проти раку 8, 9, 10. Як тимчасовий орган, який обмінюється поживними речовинами та відходами між матір'ю та плодом, плацента також виявляє вищу експресію гена, пов'язаного з раком, включаючи IGF2, HIF-2a, GPC3, пов'язаний з вагітністю білок плазми A (PAPP-A) та MUC1 11 .

Як член сімейства білків теплового шоку (HSP) з 90, gp96 має унікальну здатність зв'язуватися з антигенними пептидами, представляти ці завантажені антигени до молекул MHC класу I та II та активувати специфічні Т-клітини 12, 13. Наші попередні дослідження показують, що при раку печінки, інфікованому вірусом гепатиту В (HBV), gp96 зв'язує пептиди, похідні вірусу, і активує специфічні відповіді CTL, представляючи антиген 14, 15. Крім того, останні дослідження дають переконливі докази активації gp96 макрофагів та дендритних клітин шляхом взаємодії з підмножиною Toll-подібних рецепторів (TLR) або CD91 16, 17, 18, 19. Клінічні дослідження з використанням аутологічних гп96-пептидних комплексів як терапевтичних вакцин були розпочаті для лікування ряду пухлин з легким протипухлинним ефектом 20. На основі вищезазначених спостережень, метою цього дослідження було визначити, чи викликає gp96 (P-gp96), що походить з плаценти, профілактичні протипухлинні відповіді Т-клітин.

результат

Спочатку ми перевірили здатність вакцини gp96, отриманої з плаценти, запобігати пухлинам за допомогою аналізів на пухлинні ураження. Білок Gp96 екстрагували з плаценти або тканин печінки мишей C57BL/6, як описано вище 21. Мишей C57BL/6 імунізували підшкірно тричі з допомогою плаценти gp96 (P-gp96), печінки gp96 (L-gp96) або PBS (без імунізації) в якості контролю. Через тиждень після останньої імунізації мишей стимулювали підшкірно клітинами меланоми B16-F10 (5 х 104 клітин/миша). Порівняно з L-gp96 або PBS, імунізація P-gp96 значно пригнічувала ріст пухлини, зменшуючи об'єм пухлини приблизно на 49 або 45% на 30 день (обидва P

отримані

Далі ми перевірили, чи імунізація P-gp96 може забезпечити довгостроковий захисний протипухлинний імунітет. Мишей C57BL/6 вакцинували три рази P-gp96 або L-gp96, отриманими від мишей C57BL/6. Через три місяці після останньої імунізації мишей підшкірно інокулювали B16-F10 (5 х 104 клітин/миша). Порівняно з відсутністю лікування, ріст пухлини сповільнювався у мишей, які отримували P-gp96, але не L-gp96 (P-gp96).

Самки мишей C57BL/6 (a - d) або BALB/c (e - h) імунізували три рази P-gp96, L-gp96 або PBS. Через три місяці після третьої імунізації мишам вводили 5 х 104 клітин B16-F10 або 6 х 105 клітин TUBO підшкірно. (a, e) Навантаження на пухлину вимірювали з інтервалом у 2 дні. (b, f) Діаграма Каплана-Мейєра виживання мишей після різних щеплень. (c, g) Спленоцити імунізованих мишей стимулювали B16-F10 (c) або TUBO (g) цільноклітинними антигенами лізату або BSA для фонової оцінки та аналізували за допомогою IFN-γ ELISPOT. (d, h) Спленоцити стимулювали опроміненими клітинами B16-F10 (d) або TUBO (h) in vitro протягом 3 днів та аналізували на цитотоксичну активність FACS, використовуючи мічені CFSE клітини B16-F10 або клітини TUBO як клітини-мішені. Смужки помилок означають sd ** P

обговорення

Наше дослідження показало, що gp96, виділений з плаценти, ініціює специфічні для пухлини відповіді Т-клітин через зв'язок з антигенами ембріональної карциноми, а імунізація gp96 забезпечує профілактику проти ксенотрансплантатів пухлини, а також канцерогенних або спонтанних ракових захворювань. Враховуючи антигенну схожість між раком та ембріональними тканинами 7 та здатність gp96 зв'язувати весь пептидний репертуар, сформований у клітині 13, наші результати, отже, забезпечують раціональну основу для розробки багатовалентної профілактичної вакцини проти раку.

методи

Зразки людини

Нормальні тканини печінки були отримані з невикористаних порцій п'яти печінкових печінок, які використовувались для трансплантації печінки в лікарні You'an у Пекіні, Центральний університет медичних наук. Зразки плаценти були взяті у п’яти жінок, госпіталізованих до третьої лікарні Пекінського університету з липня 2011 року по грудень 2011 року. Усі учасники дослідження надали письмову інформовану згоду. Протокол дослідження був затверджений Комітетом з етики Пекінської лікарні You'an та Комітетом з етики Третьої Пекінської лікарні.

Клітинні лінії

TUBO - це клонована клітинна лінія, що генерується із спонтанної пухлини молочної залози від миші BALB-neuT і сильно експресує білок HER-2 на клітинній мембрані. Клітини TUBO культивували в середовищі DMEM (GIBCO), що містить 10% фетальної телячої сироватки (FBS), 25 мкг/мл стрептоміцину та 100 МО/мл пеніциліну. Клітини B16-F10 культивували в середовищі RPMI 1640 (GIBCO) з додаванням 10% FBS, 25 мкг/мл стрептоміцину і 100 МО/мл пеніциліну.

Миші та щури

Самки мишей BALB/c (віком 6-8 тижнів) та мишей C57BL/6 (віком 6-8 тижнів) були придбані в Центрі досліджень тварин при медичному відділі Пекінського університету (Пекін, Китай). FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 миші Mul/J (віком від 6 до 7 тижнів) люб'язно надав проф. Mingzhao Zhu (Інститут біофізики Китайської академії наук, Пекін, Китай). Самки щурів Wistar (віком 6-7 тижнів) були отримані від Beijing HFK Bio-technology Co. ТОВ (Пекін, Китай). Всі експерименти на мишах і щурах проводились у суворій відповідності до норм Інституту мікробіології Китайської академії наук Комітету з етики досліджень.

Приготування gp96

P-gp96 миші, щура та людини та L-gp96 миші очищали за допомогою афінної хроматографії ConA-Sepharose з подальшою аніонообмінною хроматографією на мишах, щурах та плацентах людини або тканинах печінки. .

Щеплення мишам та щурам

У профілактичних дослідженнях мишей BALB/c та C57BL/6 імунізували шляхом підшкірної ін’єкції в черевну порожнину 20 мкг P-gp96/миші, 20 мкг L-gp96/миші або PBS поодинці на 1, 2 та 4 тижні. під час третьої імунізації мишам вводили 6 х 105 клітин TUBO/миші або 5 х 104 клітин В16-F10/миші підшкірно. У терапевтичних дослідженнях мишей BALB/c стимулювали підшкірно 6 х 105 клітин TUBO/миша. На другий день мишей імунізували 20 мкг P-gp96/миші, 20 мкг L-gp96/миші або PBS поодинці тричі через триденні інтервали. Для оцінки довгострокового захисного імунітету мишей BALB/c та C57BL/6 імунізували підшкірною ін'єкцією в черевні боки 20 мкг P-gp96/миші, 20 мкг L-gp96/миші або PBS поодинці на 1-2 тижні. та 4. Через три місяці після третьої імунізації мишам вводили підшкірно 6 х 105 клітин TUBO/миші або 5 х 104 клітин В16-F10/миші. Кожна група містила щонайменше 10 мишей. Потім розмір пухлини вимірювали через день. Мишей спостерігали протягом 50 днів, щоб вижити.

Самкам мишей FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J інокулювали підшкірним введенням в черевну порожнину 25 мкг P-gp96/миші, 25 мкг L-gp96/миші або PBS тричі на 1, 2 та 4 тижні Виникнення та ріст пухлини контролювали через рівні проміжки часу. Самка щурів Wistar вакцинували підшкірною ін'єкцією в черевну порожнину по 25 мкг P-gp96/щур або PBS тричі на 1, 2 і 4. тижнях. Через тиждень після останньої імунізації щурів стимулювали до розвитку раку молочної залози шляхом надання 20 мкг/100 г маси тіла. Маса DMBA (Sigma) в 1 мл кукурудзяної олії за допомогою шлункового зонда. Експеримент було припинено через 21 тиждень після впливу DMBA.

Розмір пухлини визначали, вимірюючи найменший діаметр (а) та найбільший діаметр (б) штангенциркулем. Об'єм пухлини розраховували за формулою: V = (a2b)/2.

Підготовка та імунізація постійного струму

Кістковий мозок видаляли із стегнових і гомілкових кісток мишей C57BL/6 або BALB/c шляхом промивання медулярного каналу PBS. Кістковий мозок фільтрували через нейлоновий клітинний фільтр розміром 100 мкм перед тим, як еритроцити лізували в 0,83 М NH 4 CL буфері. Клітини ресуспендували в RPMI 1640 з добавкою 10% фетальної телячої сироватки, 100 од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 50 нг/мл рекомбінантного мишачого GM-CSF (R&D Systems) і 20 нг/мл рекомбінантного мишачого IL-4 ( R&D Systems) у концентрації 1 х 107 клітин/мл та культивували при 37 ° C. Попередники постійного струму культивували, додаючи 2 мл середовища кожні два дні. На 7 день DC збирали та стимулювали лізатами пухлинних клітин B16-F10 або TUBO у концентрації 50 мкг білка/мл протягом 24 годин. Частка DC в культурі становила постійно 90%, як визначали за допомогою аналізу проточної цитометрії.

Мишей BALB/c та C57BL/6 імунізували підшкірною ін'єкцією в черевну порожнину 20 мкг P-gp96/миша, 1 x 106 DC/миша або PBS поодинці на 1, 2 та 4 тижнях. третя імунізація, мишам вводили 6 х 10 5 клітин TUBO/миші або 5 х 10 4 клітин B16-F10/миші підшкірно.

Адоптивний перенесення Т-клітин

Спленоцити виділяли з селезінок мишей, імунізованих P-gp96, імунізованих L-gp96 або неімунізованих (PBS), як описано. CD3 + Т-клітини збагачувались (> 90%) магнітним розділенням гранул (Miltenyi, Biotec, Німеччина) від культивованих спленоцитів. Очищені Т-клітини (2x107) вводили внутрішньовенно опроміненим γ-опроміненим (500 рад) мишам BALB/c з подальшим підшкірним впливом 6 х 105 клітин TUBO/миші. Розмір пухлини вимірювали через рівні проміжки часу, а мишей контролювали протягом 50 днів для виживання.

Колекція периферійних одноядерних клітин (PBMC)

PBMC були виділені із свіжогепаризованої крові п’яти здорових донорів методом градієнтного центрифугування Ficoll-Hypaque (GE health).

Аналіз імуноферментного плями (ELISPOT)

Тести на мишачих IFN-γ та ІФН-γ ELISPOT людини проводили згідно з протоколом, наданим виробником (Mabtech, Mariemont, OH). Коротко, до лунки в три повтори додавали ізольовані спленоцити мишей або людські РВМС (при зазначеній кількості клітин/лунку, що імпульсувала різними стимулами, відповідно) та інкубували при 37 ° С протягом 18-36 годин. Клітини для фарбування (SFC) підраховували та аналізували за допомогою зчитувача ELISPOT (Biosys, Німеччина). Зазначені контрольні пептиди використовували як фоновий контроль.

Тест на цитотоксичність Т-клітин

Цитоліз визначали за допомогою 5- (6) -карбокси-флуоресцеїн-сукцинімідилового ефіру (CFSE) та йодиду пропідію (PI) двома флюорохромними плямами. В якості ефекторних клітин використовували миші спленоцити або людські РВМС. Клітини B16-F10, TUBO та MCF-7 використовували в аналізі як клітини-мішені. Клітини-мішені попередньо мітили CFSE і змішували з ефекторними клітинами в різних співвідношеннях в кінцевому обсязі 200 мкл. Після 5 годин інкубації при 37 ° С мертві клітини мітили PI. Зразки аналізували шляхом сортування активованої флуоресценцією клітин (FACS) за допомогою програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences).

ПЛР-аналіз у реальному часі

імуноцитохімія

Пухлини молочної залози щурів, фіксовані в 4% забуференному формаліні, вбудовували в парафін за допомогою звичайної автоматизованої системи. Вкладені в парафін тканини (зрізи 5 мкм) фарбували гемотоксилін-еозином.

Статистичний аналіз

Значення виражаються як середнє значення ± SD Різниця середнього обсягу пухлини, SFC, відсотка вбивства та відносного рівня експресії мРНК між мишами, обробленими PBS, P-gp96 та L-gp96, порівнювали з t-тестом Стьюдента та дисперсійним аналізом (ANOVA) та порівняння після використання з використанням тесту Тукі. Відмінності між кривими Каплана-Мейєра порівнювали з тестом log-rank.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.