Нові підходи до діагностики лізосомних захворювань, засновані на визначенні вільних олігосахаридів у сечі

Анотація:

Діагностика лізосомних захворювань вимагає високо персоналізованого підходу, оскільки ці захворювання охоплюють широкий спектр спадкових метаболічних розладів з різними молекулярними основами. На додаток до традиційних методів, структурний аналіз вільних олігосахаридів у сечі пацієнтів за допомогою мас-спектрометрії MALDI TOF/TOF стає швидкою та перспективною альтернативою. За допомогою цього нового діагностичного підходу ми точно визначили репрезентативні профілі вільних олігосахаридів, що містяться в сечі, типові для окремих порушень метаболізму глікокон’югатів.

захворювань

Ключові слова: діагностика, глікогеноз, лізосомні захворювання, MALDI TOF/TOF

* Усі таблиці, графіки та малюнки, які є частиною статті, можна знайти у вкладеному PDF-файлі в кінці дослідження.

Вступ

Незважаючи на припущення, що до 300 000 людей у ​​Словаччині страждають на рідкісні хвороби (1), молекулярна природа цих захворювань багаторазово унікальна, і тому їх діагностика вимагає максимально персоналізованого підходу. Лізосомні порушення зберігання (ЛСД) утворюють широку групу рідкісних спадкових метаболічних захворювань, в рамках яких ми поділяємо їх на:

А.) порушення в розщепленні та деградації гліканів та глікопротеїнів (наприклад, альфа- та бета-маннозидоз, сіалідоз), гліколіпідів (наприклад, гангліозидоз GM1, хвороба Гоше та Фабрі), глікозаміногліканів (наприклад, MPS I-III) та мукополісахаридів (наприклад, MPS IV), B.) порушення в розщепленні та деградації ліпідів - сфінголіпіди (наприклад, Niemann Pick типу A або B) та триацилгліцериди, C.) порушення в деградації білка та D.) порушення лізосомних транспортних білків (наприклад, муколіпідоз III та IV ) (2).

Окремі ЛСД супроводжуються накопиченням нерозкладаних продуктів у тканинах та глікокон’югатів у сечі через недостатню активність лізосомно-розкладаючих ферментів (гідролаз). Деякі з них, напр. вільні олігосахариди (ФОС) мають характерний профіль, характерний для захворювання. FOS можна виявити за допомогою швидкого, точного та неінвазивного діагностичного методу - тандемної мас-спектрометрії MALDI-TOF/TOF, який точно визначає структурний склад накопичених олігосахаридів у сечі та є альтернативою традиційним скринінговим методам, таким як тонкошарова хроматографія ( TLC), порівнюючи рухливість FOS, присутніх у зразку, зі стандартною сумішшю олігосахаридів з 1-9 одиницями гексози. Цей метод є підходящим підходом початкового скринінгу, у випадку прикордонного, відповідно. Однак при позитивному результаті необхідна подальша характеристика спостережуваного профілю. Високоефективний аналіз MALDI TOF/TOF є відповідним додатком, щоб визначити, чи накопичувана ФОС походить з раціону, чи складається з патологічних специфічних метаболітів.

Захворювання ЛСД характеризуються мультисистемними клінічними ознаками зі стійким прогресуванням через постійне накопичення недеградованого субстрату. Деякі симптоми спочатку можуть здаватися незначними, відповідно. типовий для іншого або більш поширеного захворювання (наприклад, блювота, гіпоглікемія, гіпотонія, млявість, судоми, глухота, загальна недостатність процвітання, відставання в психомоторному розвитку) і може виникати в будь-якому віці, від внутрішньоутробного до старечого. Поширеність ЛСД у сукупності становить до 1: 5000 живонароджених (3), і тому їх рання та достовірна діагностика є важливим фактором, що впливає на життя пацієнтів та їх сімей. Відділ глікобіології Інституту хімії Словацької академії наук у співпраці з Центром спадкових метаболічних розладів NÚDCH у Братиславі представив та оптимізував аналітичний метод для профілів вільних олігосахаридів у сечі, який має високу точність, специфічність, чутливість і може бути застосовується на додаток до початкового діагностичного підходу, а також у випадку контролю ефективності терапії.

Матеріал і метод

Зразки сечі, відібрані у пацієнтів з різними лізосомальними захворюваннями (бета-маннозидоз, альфа-маннозидоз, різні типи мукополісахаридозів, муколіпідоз, гангліозидоз I та II типів, сіалідоз) та глікогеноз II. тип (хвороба Помпе), відповідно від здорових фізіологічних суб'єктів як негативний контроль, зберігали при -20 ° C до обробки. Після видалення нерозчинного осаду розбавлену сечу ліофілізували, а висушені таким чином зразки дериватизували шляхом перметилювання (PerMe) йодомметаном в основному середовищі NaOH, надлишок якого згодом видаляли екстракцією хлороформом. Після висихання підготовлені PerMe FOS відновлювали у 50% метанолі та наносили на тарілку MALDI у співвідношенні 1: 1 з матрицею 2,5-дигідроксибензойної кислоти. Аналіз FOS PerMe проводили на тандемному мас-спектрометрі (UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF, Bruker Daltonics, MA, США) в режимі позитивно-іонних рефлектонів. Пост-аналітична інтерпретація вимірюваних спектрів була оброблена програмами GlycoWorkbench та ProteinScape 3.0.

Результати

Характерні сечові профілі для 7 відібраних ЛСД визначали шляхом аналізу перметильованої ФОС. Кілька стандартних вільних олігосахаридів спостерігали у спектрах FOS контрольних зразків (здорові контролі), які присутні серед усіх вікових груп, особливо m/z 838,40, 879,43, 1240,61 та 1 274,62. Специфічні ФОС, отримані з грудного молока, були підтверджені в спектрах немовлят на грудному молоці. Отримані результати аналізу профілю FOS відповідають даним, опублікованим у літературі (4,5).

Профілі представників FOS LSD (малюнок 1), отримані методом аналізу MALDI TOF/TOF перметильованих олігосахаридів, що містяться в сечі пацієнтів, являють собою типовий олігосахаридний склад, що виникає внаслідок дисфункції або меншої активності специфічних лізосомних гідролаз:

Обговорення

Аналіз вільних олігосахаридів у сечі 7 еталонних зразків пацієнтів з ЛСД за допомогою мас-спектрометрії (MALDI TOF/TOF) виявив структурний склад присутніх олігосахаридів. Визначення точної структури олігосахаридів разом із скринінговими методами, що використовуються, є ефективним та швидким методом діагностики окремих лізосомних захворювань перед подальшим молекулярно-генетичним аналізом. Його перевага, крім високої чутливості та точності, полягає в передумові простої автоматизації у 96- та багатолунковому форматі, яка може бути використана у випадку повномасштабного скринінгу або скринінгу новонароджених.

Профілювання та створення довідкових баз даних вільних олігосахаридів, що містяться у зразках пацієнтів із цими захворюваннями, залежить від наявності зразків. Ми характеризуємо наявність специфічних вільних олігосахаридів у сечі семи генетично підтверджених ЛСД-захворювань, отриманих від Центру успадкованих метаболічних розладів NÚDCH у Братиславі. З міжнародних баз даних ми знаємо кілька інших еталонних спектрів ЛСД, напр. при фукозидозі, аспартилглюкозамінурії, хворобі Гоше та інших (4,5). Оскільки це дуже рідкісні захворювання, можливість додавання довідкових профілів FOS обмежена залежно від кількості діагностованих пацієнтів з ЛСД. Наприклад, на сьогоднішній день у Словаччині немає пацієнтів, які страждають на фукозидоз. Однак, завдяки постійно розвивається надійному скринінгу та ранньому виявленню пацієнтів, можна буде поступово додавати профілі FOS усіх 60 захворювань ЛСД та проводити детальне дослідження, в якому також обговорюватимуться результати профілів ФОС залежно від віку, захворювання прогресування тощо. Співпраця між лікарями та науковими лабораторіями сприяє перевірці та більш ретельному уточненню неоднозначних, відповідно. межові дані при селективному скринінгу на підозру на ЛСД.

Висновок

Тонкошарова хроматографія (ТШХ) в даний час є основним і стандартним методом аналізу вільних олігосахаридів у сечі в клінічних лабораторіях. ТШХ має обмеження в специфічності та чутливості аналізів і не забезпечує структурного аналізу олігосахаридів ФОС, який часто необхідний для діагностики лізосомних захворювань. У серії з декількох захворювань на ЛСД та контрольних зразків сечі ми застосували методи мас-спектрометрії MALDI TOF/TOF та визначили структури домінантних олігосахаридів для вибраних підтипів. Представлений метод має значну користь у діагностиці ЛСД, прискорює процес прийняття рішень і в даний час доступний у Словаччині для пацієнтів із підозрою на одне з вищезазначених лізосомних захворювань.

Конфлікт інтересів: Автори заявляють, що у них немає конфлікту інтересів, і в той же час чесно заявляють, що робота не друкувалася в іншому періодичному виданні.

Подяки: Ця робота була підтримана Міністерством охорони здоров'я Словацької Республіки в рамках проекту з реєстраційним номером 2019/7-CHÚSAV-4 та грантом №. 2/0130/18 Словацьке грантове агентство з питань науки VEGA.

Муколіпідоз ML2 (GNPTAB) - накопичення різних FOS із змінними кінцевими моносахаридами - маноза, галактоза або сиалова кислота спостерігається в спектрі через недостатню функцію деяких лізосомальних гідролаз, сіалідаз, бета-галактозидаз або альфа-маннозидаз, ферментів із використанням продуктів GlcNAc-фосфотрансферази (GNTP).