Статті

ОСНОВИ ЕСПЕРМАТИЧНОЇ КРІІОБІОЛОГІЇ ДЛЯ БАНКІВ

Ана Фернандес 1, Марія дель Кармен Гонсальво 1 Ана Клаверо 1, Рафаель Руїс де Ассін 1, Сандра Замора 1, Марія Ролдан 1, Белен Рабело 1, Хуан Пабло Рамірес 2,3 Альберто Йолді 2, Хосе Антоніо Кастілья 1,2,3
1 відділ репродукції людини, Університетська лікарня “Virgen de las Nieves”, Гранада.
2 CEIFER Semen Bank, Гранада.
3 Зовнішня програма контролю якості для лабораторії розмноження Асоціації з вивчення біології розмноження (ASEBIR), Мадрид.

основи

Опубліковано в журналі 14 червня 2009 р.

Короткий зміст: Сперматозоїди мають особливі характеристики заморожування, в цій роботі проаналізовано ці характеристики та їх вплив на виживання сперми, застосованих до сперми. Сюди входять фактори, характерні для типу клітини, яку слід заморозити, та фактори, що залежать від протоколу заморожування. Серед перших ми можемо говорити про розмір та проникність клітин, а серед останніх ми знаходимо криву замерзання та додавання кріопротекторів.

Крива замерзання відноситься до клітинної реакції на замерзання (холодний шок, обледеніння та відтавання), яка може спричинити кріоіндуковані ураження, такі як внутрішньоклітинне утворення льоду, осмотичний стрес або перекристалізація. Щоб уникнути цих пошкоджень, усі протоколи описують як фундаментальну частину додавання кріозахисних речовин, корисних для виживання клітин, хоча вони також включають шкідливі аспекти, такі як їх токсичність. Нарешті, будуть проаналізовані основи та роль склоподібності сперми в банках сперми.

Ключові слова: сперма, кріобіологія, вітрифікація

БАЗИ КРІОБІОЛОГІЇ СПЕРМИ, ЩО ЗАСТОСОВУЮТЬСЯ ДО СПЕРМАНІВ

Короткий зміст: Сперматозоїди мають особливі заморожувальні характеристики, у цій роботі аналізуються ці характеристики та вплив на виживання сперми, що застосовується до сперматозоїдів. Серед них ми знаходимо конкретні фактори заморожування залежно від типу клітини та протоколу заморожування. Серед них ми почнемо з розміру та клітинної проникності, а по-друге, розглянемо криву замерзання та додавання кріопротекторів.

Крива замерзання відноситься до клітинної реакції на замерзання (холодний шок, утворення льоду та відтавання), що може спровокувати такі криотравми, як внутрішньоклітинне утворення льоду, осмотичний стрес або повторна кристалізація. Щоб уникнути цих пошкоджень, усі протоколи як основний захід описують додавання кріозахисних агентів як корисного для виживання клітини, хоча вони також завдають шкідливих аспектів через свою токсичність. Нарешті будуть проаналізовані основи та роль склопакету сперматозоїдів у банках сперми.

Ключові слова: банк сперми, кріобіологія, вітрифікація

ВСТУП

Основною метою кріоконсервації сперми є підтримка їх життєздатності та функціональності при низьких температурах протягом тривалого періоду часу. Кріоконсервовані клітини зберігаються при -196 ° C у рідкому азоті. При цій температурі немає ні дифузійних явищ, ні достатньої теплової енергії для проведення хімічних реакцій. Отже, труднощі з заморожуванням виникають не внаслідок перебування при низьких температурах, а в процесі охолодження та нагрівання.

Під час цих процесів клітини знаходяться у суспензії у водному розчині. Зазначений розчин матиме колігативні властивості, які залежать принципово від кількості молекул у ньому, а не від їх природи. Таким чином, додавання розчину в розчин знижує температуру замерзання (кріоскопічну точку) і тиск пари, а також збільшує осмотичний тиск і температуру кипіння. Осмос - це переміщення води від розчинів з низькою концентрацією розчиненої речовини до розчинів з високою концентрацією розчиненої речовини, а осмотичний тиск - це гідростатичний тиск, який утворюється через напівпроникну мембрану з градієнтом концентрації. Ці властивості слід пам’ятати, коли при зниженні температури в процесі заморожування у позаклітинному середовищі починає утворюватись лід, оскільки вода, що входить до складу льоду, не містить розчинених речовин, що розчинилися, збільшуючи їх концентрацію в позаклітинне середовище (гіперосмотичне) та зміна колігативних властивостей цього.

Під час цих процесів клітини поводяться як осмометри, змінюючи об’єм у відповідь на позаклітинні осмотичні зміни, таким чином клітини втрачають або захоплюють воду залежно від того, чи піддаються вони гіпер- або гіпоосмотичним позаклітинним середовищам; переміщення води та кріопротекторів крізь клітинну мембрану під час кріоконсервації регулюються різними біофізичними параметрами, які повинні бути визначені для кожного типу клітин при різних температурах, і в кінцевому рахунку нестимуть шкоду клітинам.

ЗАГАЛЬНІ КОНЦЕПЦІЇ ТРАНСПОРТУВАННЯ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНИ ПІД ЧАС МОРОЗИНИ І РОЗМОРОЖЕННЯ

Як приклад можна розглянути клітину як «мішок», наповнений сольовим розчином, зануреним у морозильне середовище (позаклітинне середовище). Обгортання мішка, тобто клітинна мембрана, матиме напівпроникні мембранні властивості.

Дві основні характеристики, які визначатимуть поведінку мембрани, це: розмір та проникність.

РОЗМІР

Це зона мембрани, доступна для обміну водою із зовнішнім середовищем.

ПРОСТОЙЛИВІСТЬ.

Цей параметр визначає легкість проходження води через мембрану перед градієнтом концентрації. Проникність клітинної мембрани регулюється законом, який відображає емпіричний факт, що чим нижча температура системи, тим менша проникність мембрани. Таким чином, клітинна мембрана втрачає свій напівпроникний характер, стаючи непроникною, нижче певної критичної температури. Коли ми охолоджуємо систему нижче цієї критичної температури, процес зневоднення зупиняється, це призводить до збільшення ймовірності утворення внутрішньоклітинного льоду. Лабораторні експерименти показують, що проникність клітинної мембрани, крім того, що змінюється залежно від температури системи, також залежить від концентрації розчиненої речовини в позаклітинному середовищі.

Вміст "мішка", тобто внутрішньоклітинного середовища, буде складатися з двох областей:

ОСМОТИЧНО НЕАКТИВНИЙ ОБ'ЄМ

У цю область ми включаємо внутрішні клітинні органели, клітинне ядро, макромолекули, такі як білки тощо. Вони є внутрішніми частинами клітини, які не втручаються у процес водного транспорту. Він визначається як вода, яка ніколи не вийде з клітинного середовища у відповідь на збільшення концентрації розчинених речовин у позаклітинному просторі, оскільки вона пов’язана з макромолекулами та внутрішньоклітинними структурами. Якщо клітина зневодниться і зменшить свій розмір за межі осмотично неактивного об’єму, її життєздатність може бути порушена (гіпотеза Мерімана про мінімальний об’єм для пояснення пошкодження клітини під час заморожування) (Мериман, 1970).

ОСМОТИЧНО АКТИВНИЙ ОБ'ЄМ

У цю область ми включаємо внутрішньоклітинний розчин, у якому плавають внутрішні органели, ядро ​​тощо, і який може залишити клітину.

КЛІТИНОВА РЕАКЦІЯ НА ЗАМЕРЗАННЯ

ШКОД ХОЛОДНОГО ШОКУ І ОХОЛОДЖЕННЯ (ВІД 37ºC ДО 0ºC)

Холодний шок - це пошкодження клітин, спричинене чутливістю до швидкості охолодження, і спричинене перехідними ефектами в ліпідній фазі (Drobnis et al., 1993). Травма охолодження - це пошкодження внаслідок чутливості до певної температури або діапазону температур.

Жирні кислоти можуть існувати в упорядкованому жорсткому стані (гель) або в більш гнучкому і відносно невпорядкованому стані (рідина). Перехід з одного стану в інший відбувається за діапазону температур, середня з яких відома як температура фазового переходу ("температура плавлення", Тм). Ця температура переходу буде вищою або нижчою залежно від складу жирних кислот мембрани. Більшість мембран еукаріотичних клітин мають свій Tm від 0 ° C до 20 ° C.

Фазовий перехід у плазматичній мембрані не відбувається одночасно у всіх її фосфоліпідах, і тому під час переходу очікується співіснування доменів у рідкому стані та доменів у гелевому стані. Ця ситуація створює дефекти упаковки мембран і пов'язана з більшою проникністю розчинених речовин через неї. Таким чином, було показано, що при досягненні температури переходу в даному бішарі найбільша втрата розчинених речовин відбувається через мембрану.

Крім того, ця зміна спричиняє фізичні зміни плазматичної мембрани через індукцію руйнувань ліпідної упаковки; тимчасові зміни ліпідної фази викликають нелінійні кінетичні реакції деяких ферментів, включаючи деякі мембранні АТФази. Цілком ймовірно, що такі ефекти частково відповідають за поганий контроль клітинної концентрації кальцію, що виявляється при температурах нижче 17 ºC (Bailey et al., 1994).

Тепловий шок можна пом'якшити кріозахисними агентами, наявністю певних фосфоліпідів (фосфатидилсерин), повільним заморожуванням та попереднім кондиціонуванням у середовищі з високим рівнем солей. Схоже, на сперму людини мало впливає холодний шок та пошкодження холодом, ймовірно, завдяки складу мембрани (Holt, 2000).

ЛОДОФОРМАЦІЯ (0ºC до 2500ºC/хв., Яка може утворювати внутрішньоклітинні кристали льоду та спричиняти пошкодження сперматозоїдів. Для збільшення швидкості заморожування використовуються інші пристрої, крім класичної соломи, що забезпечують більший контакт між суспензією клітини та рідким азотом такі як сітки електронної мікроскопії, напівсоломки, кріолуп, кріотоп, кріотип та кріоліф (Fuller et al., 2004). Швидкість охолодження та нагрівання може збільшуватися до 30000 ° C/хв та 42000 ° C/хв відповідно, і таким чином успішно уникати утворення внутрішньоклітинного льоду. Для досягнення цієї високої швидкості необхідно, щоб обсяг, де містяться сперматозоїди, був дуже малим (мкм), що робить кількість склоподібних сперматозоїдів дуже низьким, цей метод не є корисним для заморожування сперми для штучного запліднення або ЕКО, лише для ІКСІ.

Однак було помічено, що сперматозоїди можуть бути відновлені за допомогою методів вітрифікації без залежності від CPA, використовуючи дуже високі швидкості охолодження, які можуть певною мірою залежати від високої вродженої проникності мембрани для води (Isachenko et al., 2004) або використання сахарози (Hossain et al., 2007) або гліцерину (Schuster et al., 2003) як єдиного кріопротектора. Отже, роль методів витрифікації сперми ще не з’ясована.

Список літератури

Merryman HT. Перевищення мінімально допустимого об’єму клітин у гіпертонічній суспензії як причина замерзання. В: О'Коннор ГЮ (ред.) Заморожена клітина. Симпозіум Фонду CIBA. Churchill Press, Лондон 1970; 565-9.

Drobnis EZ, Crowe LM, Berger T, et al. Пошкодження холодним шоком обумовлено переходом ліпідної фази в клітинні мембрани - демонстрація використання сперми як моделі. J Exp Zool 1993; 265: 432–7.
Бейлі Дж. Л., Робертсон Л., Бур М.М. Взаємозв'язки між фертильністю in vivo, аналізованою комп’ютером моторикою та потоком Ca2 + in vitro у сперматозоїдах великої рогатої худоби. Can J Anim Sci 1994; 74: 53–8.

Мазур П. Роль внутрішньоклітинного заморожування у загибелі клітин, охолоджених із супраоптимальними показниками. Кріобіологія 1977; 14: 251-72.

Фуллер Б, Пейнтер С. Основи кріобіології в репродуктивній медицині. RBM на лінії 2004; 9: 680-91.

Мазур П. Кінетика втрати води з клітин при мінусовій температурі та ймовірність внутрішньоклітинного заморожування. J Gen Physiol 1963; 47: 347-69.
Rall W, Reid D, Farrant J. Нешкідливе біологічне заморожування під час потепління. Nature (Лондон) 1980; 286: 511-4.

Хольт В.В. Основні аспекти замороженого зберігання сперми. Anim Reprod Sci, 2000; 62: 3-22.

Nei T. Будова та функція заморожених клітин: закономірності заморожування та виживання після відлиги. J Microsc 1978; 112 (2): 197-204.

Мазур П. Заморожування живих клітин: механізми та наслідки. Am J Physiol 1984; 247, C125 - C142.

Leibo SP, Farrant J, Mazur P et al. Вплив заморожування на суспензії стовбурових клітин кісткового мозку: взаємодія швидкості охолодження та зігрівання у присутності PVP, сахарози або гліцерину.
Кріобіологія 1970; 6: 315–32.

Nei T. Механізм гемолізу еритроцитів шляхом заморожування, з особливим посиланням на заморожування при нульовій температурі. У: Wolstenholme, G.E.W., O'Connor, M. Eds., Заморожена клітина. Черчілль, Лондон, 1970; 131–47.

Mazur P, Leibo SP, Farrant J, et al. Взаємодія швидкості охолодження, швидкості зігрівання та захисної добавки на виживання заморожених клітин ссавців. У: Wolstenholme, G.E.W., O'Connor, M. Eds., The Frozen Cell, London: Churchill; 1970 69–88.

Lovelock JE. Гемоліз еритроцитів людини шляхом заморожування та розморожування. Biochim Biophys Acta 1953; 10 (3): 414-26.

Karow AM Jr., Webb WR. Заморожування тканин. Теорія травм та виживання. Кріобіологія 1965; 2 (3): 99-108.

Nijs M, Ombelet W. Кріоконсервація сперми людини. Hum Fertil 2001; 4: 158-63.

Gao D, Liu J, Liu C, et al. Запобігання осмотичного пошкодження сперматозоїдів людини під час додавання та видалення гліцерину. Hum Reprod 1995; 10: 1109-22.

Gilmore JA, Liu J, Gao DY та ін. Визначення оптимальних кріопротекторів та процедури їх додавання та виведення із сперматозоїдів людини Hum Reprod 1997; 12: 112–8.

Lovelock JE, Polge C. Іммобілізація сперматозоїдів шляхом заморожування та розморожування та захисна дія гліцерину. Biochem J 1954; 58: 618–22.

Hammerstedt RH, Graham JK. Кріоконсервація сперми птиці: загадка гліцерину. Кріобіологія 1992; 29: 26–38.

Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Кріоконсервація сперми ссавців: що ми просимо їх вижити. J Androl 1990; 11: 73–88.

Gilmore JA, McGann LE, Liu J, Gao et al. Вплив розчинених речовин кріопротекторів на водопроникність сперматозоїдів людини. Biol Reprod 1995; 53: 985–995.

Тейлор MJ, Song Y, Brockbank KG. Вітрифікація при збереженні тканин: нові розробки. В: Fuller BJ, Lane N, Benson EE (eds) Життя в замороженому стані. CRC Press, Boca Raton, Флорида, США, 2004; 603–42.

Хоссаїм А.М., Осуамкпе CO. Поодиноке використання сахарози при кріоконсервації сперми людини. Arc Androl 2007; 53: 99-103.

Шустер Т.Г., Келлер Л.М., Данн Р.Л. та ін. Ультрашвидке заморожування дуже низької кількості сперми за допомогою кріопетель. Hum Reprod 2003; 18: 788-95.