предметів
реферат
Сухожилля - це щільні сполучні тканини, що складаються в основному з колагену I типу, які передають сили між м’язами та кістками і необхідні для рухової структури.
Цукровий діабет II типу (T2DM) - це метаболічне захворювання, яке характеризується гіперглікемією та зниженням чутливості до інсуліну 1 і сильно пов’язане з ожирінням 2. Хоча важко відірвати системні наслідки діабету II типу від ожиріння, очевидно, що індукція ожиріння/T2DM призводить до серйозних змін метаболічної функції, що призводить до різних патологічних змін у всьому організмі 3 .
В даний час відомо дуже мало про клітинні та молекулярні механізми, що лежать в основі діабетичної тендинопатії, хоча патологічні зміни збільшуються залежно від тривалості T2DM 6. Щоб розпочати усунення цього прогалини в знаннях, ми використовували мишачу модель ожиріння, спричиненого дієтою, та діабету II типу 14, щоб перевірити гіпотезу про те, що сухожилля згиначів у мишей із ожирінням та діабетом будуть прогресивними, патологічними змінами в роботі суглобових функцій та механічних властивостях. Ми також досліджували вплив нормальної метаболічної функції на відновлення як потенційний засіб скасування або зупинки діабетичної тендинопатії. Нарешті, через втрату чутливості до інсуліну, що спостерігається у сухожиллях із ожирінням/T2DM, ми генерували специфічні для сухожиль рецептори інсуліну (IR), кондиціоновані у нокаутованих мишей, щоб визначити, чи достатньо видалення IR у сухожиллі для рекапітуляції фенотипу діабетичної тендинопатії.
результат
HFD викликає ожиріння та діабет II типу у мишей
Миші HFD мали значне збільшення маси тіла порівняно з LFD та HFD-LFD у всі часові моменти (24 тижні - LFD: 33, 75 г ± 2, 27, HFD: 49, 05 г ± 2, 24; HFD-LFD: 28, 8 г ± 7,03, с 
T2DM/ожиріння змінює функцію сухожилля та механічні властивості. ( A ) Вимірювання кута згину суглобів суглоба п'ястно-фалангового (МТР) суглоба, ( B ) Опір ковзанню, ( C. ) Максимальне навантажувальне навантаження і (( D ) Жорсткість сухожиль FDL у сухожилках LFD, HFD та HFD-LFD між 12 та 48 тижнями після початку дієти. * Позначає стор
T2DM/ожиріння змінює діаметр фібрил колагену. ( A ) ТЕМ-осьові зображення сухожилля FDL від мишей LFD, HFD та HFD-LFD через 40 тижнів після початку дієти. Відкладення ліпідів у сухожилках HFD позначені чорними стрілками. Шкала представляє 5 мкм на зображеннях із збільшенням 3500x та 0,5 мкм на зображеннях із збільшенням 40000x. ( B ) Гістограми з діаметром фібрили колагену, що показують зменшення середнього діаметра фібрили у сухожилках HFD та HFD-LFD порівняно з LFD. ( C. ) Розподіл діаметру фібрили колагену із зрощенням ділянок, що перекривають дані між 5-м та 95-м процентилями. Дані поза цим діапазоном відображаються як окремі точки. ( D ) Щільність фібрили колагену. * Позначає р15. Ми досліджували зміни в активації сигналізації рецепторів інсуліну (ІЧ) у первинних теноцитах та сухожиллях мишей, що страждають ожирінням/T2DM та без діабету. Первинні теноцити демонструють стійку активацію ІЧ-сигналізації, на що вказує підвищена експресія β-Akt у порівнянні з обробленими носієм теноцитами (рис. 4А). Після стимуляції інсуліном сухожилля мишей LFD продемонстрували сильну індукцію експресії β-Akt, що свідчить про активацію ІЧ-сигналізації. На відміну від цього, індукція p-Akt була притуплена в сухожилках HFD (рис. 4B).
Експресія і передача сигналів інсулінових рецепторів змінюються в сухожиллях діабету. ( A ) Первинні теноцити, виділені з недиабетних сухожиль миші, демонструють сильну експресію β-Akt щодо оброблених носієм теноцитів, що вказує на активацію ІЧ-сигналізації в теноцитах. ( B ) Сухожилля мишей HFD та LFD стимулювали інсуліном або носієм (0,5% BSA у PBS). Активація ІЧ-сигналізації спостерігалася в сухожилках НЧ через посилену експресію β-Akt. На відміну від цього, не спостерігалося збільшення експресії β-Akt у суглобах, стимульованих інсуліном HFD, порівняно з лікуванням носієм, що свідчить про оніміння чутливості до інсуліну у HFD сухожиль. Блоти зондували на β-Akt і демонстрували, після зняття мембрани, ті самі ляпки потім досліджували на загальний Akt. Повнометражні блоки показані на додатковому малюнку 1.
Повнорозмірне зображення
S100a4-Cre призводить до зменшення експресії рецепторів інсуліну в сухожиллі
Через втрату чутливості до інсуліну у сухожиллях мишей із ожирінням/T2DM та збільшення експресії IRp у сухожилках людини T2DM, ми дослідили ефекти делеції IRp у сухожилках за допомогою S100a4-Cre. Щоб продемонструвати, що S100a4-Cre ефективно націлений на резидентні теноцити, S100a4-Cre +; Використовували мишей-репортерів Ai9. Експресія флуоресценції A19 спостерігалася майже у всіх резидентних теноцитах (рис. 5А). Крім того, аналізи вестерн-блот показали зниження експресії IRp у S100a4-Cre +; IR F/F миші (IRcKO S100a4), порівняно зі стандартними (WT) братами та сестрами (рис. 5B). Жодних змін у відсотках жиру в організмі (рис. 5C), ваги тіла (рис. 5D) або рівня глюкози в крові натще (рис. 5E) не спостерігалося між мишами WT та IRcKO S100a4. Перехідне підвищення толерантності до глюкози спостерігалося у мишей IRcKO S100a4 через 30 хвилин після болюсного введення глюкози, але різниці в толерантності до глюкози не спостерігалось через 15, 60 або 120 хвилин (рис. 5F). Значне зменшення площі під кривою на 23% спостерігалося у мишей IRcKO S100a4 під час тесту на толерантність до глюкози (рис. 5G). Таким чином, IRcKO S100a4 дозволяє досліджувати специфічні ефекти збиття IRP при сухожиллі, незалежному від ожиріння/T2DM.
Видалення IRp в клітинах S100a4 не викликає ожиріння або T2DM. ( A ) Ефективність рекомбінації S100a4-Cre у сухожиль візуалізували за допомогою репортера A19 і демонстрували ефективну рекомбінацію в сухожиллі. ( B IRcKO S100a4 зменшує експресію білка IRp у сухожиллі порівняно з WT. Повнометражні блоки показані на додатковому малюнку 2. ( C. - Е ) Не спостерігалось змін у масі тіла між мишами WT та IRcKO S100a4 ( C. ), ( D ) відсоток жиру в крові або в крові ( Е ) у крові натщесерце через 48 тижнів. Вік. ( F - G ) IRcKOS100a4 мав більш ефективне відновлення рівня крові під час тесту на толерантність до глюкози ( F ) і як розраховується шляхом кількісного визначення площі під кривою за допомогою тесту на толерантність до глюкози ( G ).
Повнорозмірне зображення
Делеція рецептора інсуліну в клітинах лінії S100a4 не викликає діабетичної тендинопатії
Сухожилля IRcKO S100a4 мали значне збільшення кута згинання MTP (49, 87 ° ± 1, 79, p = 0,02) через 48 тижнів відносно WT (42, 37 ° ± 2, 16) (рис. 6А). Жодної зміни опору ковзанню не спостерігалось між WT та IRcKO S100a4 (WT: 19, 02 ± 2; 1; IRcKO S100a4: 17, 73 ± 1, 87, p> 0,05) (рис. 6B). Максимальне навантаження на відмову та жорсткість не суттєво відрізнялися між сухожиллями IRcKO S100a4 та WT (Макс. Навантаження: WT: 5, 92 Н ± 0, 74, IRcKO S100a4: 6, 9 Н ± 0, 7, p = 0, 36) (Рис. 6C, D). Крім того, TEM-аналізи показують, що втрата IRp у клітинах S100a4 не змінила розподіл діаметру колагенової фібрили (медіана WT: 188, 63; медіана IRCKO S100a4: 193, 32, p = 0,21) (рис. 6E-G) або щільність фібрил (Рис. 6H) (p = 0, 82) у віці 48 тижнів.
Видалення IRp у клітинах лінії S100a4 не порушує функції ковзаючих сухожиль, механічних властивостей або організації колагену. ( A ) MTP ROM, ( B ) Опір ковзанню, ( C. ) Макс. Несправність навантаження і ( D ) Жорсткість оцінювали у віці 48 тижнів у сухожилках WT та IRcKO S100a4. * Позначає p S100a4 у віці 48 тижнів. ( F ) Жодних змін у діаметрі фібрил колагену між сухожиллями WT та IRcKO S100a4 не спостерігалося. ( G ) Розподіл діаметру фібрили колагену із злиттями на ділянках, що охоплюють дані між 5-м та 95-м процентилями. Дані поза цим діапазоном відображаються як окремі точки. ( H ) Щільність колагенової фібрили на ТЕМ-зображеннях сухожиль мишей WT та IRcKO S100a4 у віці 48 тижнів.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Механічні властивості сухожилля та ПЗУ залежать від організації колагену ECM 20. Через зменшення механічних властивостей сухожиль у мишей HFD та HFD-LFD ми досліджували зміни в організації колагену та діаметрі фібрил. ТЕМ продемонструвала суттєві зміни у розподілі діаметра фібрили колагену у сухожилках HFD та HFD-LFD порівняно з LFD. Ці спостережувані зміни у розмірі фібрили можуть впливати на функцію ковзаючих сухожиль і припускати зміну архітектури фібрили колагену як механізм порушення функції сухожиль при діабетичній тендинопатії. Відповідно, клінічно спостерігається збільшення об’єму сухожиль у пацієнтів з діабетом 21 типу ІІ, що припускає, що втрата компактності колагену може перешкоджати нормальній функції ковзання, що призводить до зниження функції сухожиль та обсягу рухів.
Коротко кажучи, ожиріння/T2DM достатньо, щоб викликати незворотний каскад патологічних змін у сухожиллі згиначів, включаючи зміну організації ECM, що в кінцевому підсумку призводить до зниження механічних властивостей та сухожилля ROM. Крім того, видалення IRp у клітинах лінії S100a4 не змінює організації сухожиль ECM або функції сухожиль. Враховуючи те, що знижена чутливість до інсуліну спостерігається у сухожиллях із ожирінням/T2DM, подальше дослідження ролі IRp в інших популяціях клітин буде важливим. Нарешті, диференціація метаболічної дисфункції була недостатньою для запобігання прогресуванню хвороби сухожиль, що свідчить про те, що розуміння специфічних для сухожиль клітин та молекулярна реакція на ожиріння/T2DM буде мати вирішальне значення для успішного ведення та лікування діабетичної тендинопатії.
методи
Етика тварин
Це дослідження проводилось у суворій відповідності з рекомендаціями Керівництва Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин. Усі процедури на тваринах схвалені Університетським комітетом з досліджень тварин (UCAR) при Рочестерському університеті (номер UCAR: 2014-004).
Дієтичне ожиріння та діабет II типу
Самці мишей C57B1/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) були розміщені в групах по п’ять осіб на 12-годинному циклі світло/темрява. Через чотири тижні мишей садили на дієту з низьким вмістом жиру (LFD; 10% Ккал, дослідницькі дієти # 12450 J) або на дієту з високим вмістом жиру (HFD; 60% Ккал, дослідні дієти # D12492) на термін до 48 тижнів. Третю когорту (HFD-LFD) мишей поміщали на HFD на 12 тижнів, а потім змінювали на LFD до жертви (рис. 1А). Мишей забивали через 12, 24, 40 і 48 тижнів після початку дієти, шляхом вдихання вуглекислого газу та вивиху шийки матки.
Рецептори інсуліну опосередковують делецію мишей
Для контролю втрати IRp у дворян, IRp флокс/флокс (# 6955, Jackson Laboratories) 29 схрещували з мишами S100a4-Cre (# 12641, Jackson Laboratories) для отримання мишей IRcKO S100a4. виготовлений ко-; Брати та сестри IRp flox/flox використовувались як контролери дикого типу (WT). Для підтвердження ефективного націлювання на сухожилля мишей S100a4-Cre схрещували з мишами-репортерами Ai9 (# 7909, Jackson Laboratories) 30, що призводило до флуоресценції tdTomato після рекомбінації, опосередкованої Cre. Мишей приносили в жертву у віці 48 тижнів.
Вимірювання глюкози натще
Через 12, 24, 40 і 48 тижнів після початку дієти миші (n = 6 на дієту в момент часу) голодували протягом п’яти годин 31, зважували та вимірювали рівень глюкози в крові натще за допомогою вимірювача глюкози в крові OneTouch2 (LifeScan Inc., Мілпітас, Каліфорнія). Глюкозу в крові натще вимірювали у віці 48 тижнів у мишей IRcKO S100a4 та WT (n = 6 на генотип).
Тест на толерантність до глюкози
Щоб визначити толерантність до глюкози через 20 тижнів після початку дієти, миші LFD, HFD та HFD-LFD (n = 6 на дієту) отримували 10 мкл/г болюсу 20% глюкози в PBS шляхом інтраперитонеального введення швидко через п’ять годин. Рівні глюкози в крові вимірювали через 15, 30, 60 та 120 хвилин після болюсного введення глюкози. Толерантність до глюкози оцінювали у віці 48 тижнів у мишей IRcKO S100a4 та WT.
Оцінка жиру в організмі
Через 12 та 48 тижнів після початку дієти (48-тижневий вік у мишей IRcKO S100a4 та WT) відсоток жиру в організмі вимірювали за допомогою подвійного енергетичного рентгенівського поглинача PIXImus (DXA) (GE Lunar PIXImus, GE Healthcare, WI ). ).
Оцінка функції вітрила
Після жертви задні кінцівки збирали для ковзання та біомеханічних випробувань через 12, 24, 40 та 48 тижнів після початку дієти (n = 6 - 10 на дієту за час). Мишей IRcKO S100a4 та WT збирали у віці 48 тижнів (n = 8-10). Сухожилля FDL було виділено з міотендинозного з'єднання в тарзальний герпесний тунель, залишаючи сухожилля цілим через цифри. Проксимальний кінець сухожилля був закріплений між двома шматками стрічки за допомогою ціаноакрилату. Гомілкова кістка була закріплена власним хватом, а проксимальний кінець FDL поступово заряджався від 0 до 19 г. Після нанесення кожної ваги було зроблено зображення згинання суглобів плесно-фалангового (МТП) суглоба та виміряне за допомогою ImageJ (//imagej.net). Використовуючи ці цифри, кут вигину МТР обчислюється як різниця кута згинання МТР між ненавантаженим (0 г) і 19 г. Опір ковзанню розраховували шляхом розміщення даних про відхилення в однофазному експоненціальному рівнянні. Для визначення опору ковзанню 32 використовували нелінійну регресію .
Біомеханічне випробування на розтяг
Після тестування функції ковзання FDL було випущено з тарзального тунелю, а гомілка видалена. Проксимальний кінець FDL та цифри проводились у протилежних самозахопленнях в приладі Instron (осьова сервогідравлічна тест-система Instron 8841 DynaMight, корпорація Instron, Норвуд, Массачусетс). Сухожилля зміщувалося під напругою зі швидкістю 30 мм/хв до відмови. Жорсткість і максимальне навантажувальне навантаження розраховували за кривою зміщення сили.
Трансмісійна електронна мікроскопія
Сухожилля FDL були виділені (n = 3 на дієту або генотип) і закріплені в фіксаторі глутаральдегіду натрію какодилат. Один мікронний осьовий зріз вирізали і фарбували толуїдиновим синім. Потім один мікронний зріз розрізали до 70 нм і фарбували уранілацетатом та цитратом свинцю. Зрізи були розміщені на сітках зображення на аналітичному ПЕМ Hitachi 7650. Вісім-дванадцять зображень, що не перекриваються, були зроблені із середньої речовини кожного сухожилля при збільшенні 15000x та 40000x. Для вимірювання діаметра фібрил на кожному зображенні визначали область інтересу (ROI), щоб можна було виміряти мінімум 80 фібрил. Діаметри вимірювали вздовж осі y. Щільність колагену вимірювали в області 2340 х 1860 пікселів. Вимірювання щільності та діаметра фібрили колагену проводили в ImageJ.
Експресія та сигналізація рецепторів інсуліну
Первинні теноцити були виділені від мишей C57B1/6 J і використовувались до пасажу 3. Цілі ФТ були виділені від мишей, що годували HFD та LFD, через 48 тижнів після початку дієти (n = 3 на групу). Теноцити та сухожилля стимулювали або носієм (0,5% BSA в PBS), або 1 нМ інсуліном протягом 15 хвилин, з подальшим виділенням білка для вестерн-блот-аналізу. Блоти досліджували для фосфо-AKT Ser473 (1: 1000, клітинна сигналізація, # 4060) та для загальної AKT (1: 1000, клітинна сигналізація, # 9272 S) 33 і розробляли за допомогою хемілюмінесцентного субстрату SuperSignal West Pico або Femto та відображали на GelDocXR (BioRad, Геркулес, Каліфорнія). Для оцінки змін експресії IRp у мишей IRcKO S100a4 загальний білок екстрагували із сухожиль WT та IRcKO S100a4 (n = 3 на генотип) для аналізів вестерн-блот. Блоти досліджували за допомогою IRp (1: 300, Санта-Крус, # sc-20739) 34 і β-актину (1: 2500, Sigma Aldrich, # A2228) 35 і розробляли за допомогою хемілюмінесцентного субстрату SuperSignal West Pico або Femto та знімали на GelDocXR ( BioRad, Геркулес, Каліфорнія).
Статистичний аналіз
У дослідженнях ожиріння/T2DM масу тіла, рівень глюкози в крові, біомеханічні та ковзні дані аналізували двостороннім дисперсійним аналізом (ANOVA) з подальшим багаторазовим порівнянням Бонферроні із значенням, встановленим при a = 0,05. одностороння ANOVA з багаторазовими порівняннями Бонферроні. Статистичні відмінності між WT та IRcKO S100a4 визначали за допомогою непарних t-тестів. Всі дані були проаналізовані за допомогою статистичного програмного забезпечення Prism GraphPad 7.0. Дані представлені як середнє значення ± SEM.
Наявність даних
Ця стаття включає всі дані, отримані або проаналізовані під час цього дослідження.
Дякую
Ми хотіли б подякувати гістології, біохімії та молекулярній візуалізації (HBMI) ядра та біомеханіці, біоматеріалам та мультимодальній тканинній візуалізації ядра в Центрі опорно-рухового апарату, ядрі багатофотонної візуалізації та електронній мікроскопії при Рочестерський медичний. Центр технічної допомоги. Цю роботу підтримали гранти NIH/NIAMS K01AR068386 (AEL), P30 AR061307 Pilot (AEL), R01 AR073169 (AEL), R01 AR070765 (MRB) та Премія університету Рочестера (AEL & MRB). KM підтримувався 3T32 AR053459-10S1. Ядро гістологічних, біохімічних та молекулярних зображень (HBMI) та біомеханіка, біоматеріали та ядро мультимодальних зображень тканин (BBMTI) частково підтримуються P30 AR069655. Вміст несе виключну відповідальність авторів і не обов’язково відображає офіційні погляди Національних інститутів охорони здоров’я.
Електронний додатковий матеріал
Додаткова інформація
Коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.