іонного

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Функціональне вираження TRPM8 у популяціях макрофагів
  • TRPM8 модулює експресію цитокінів у макрофагах
  • TRPM8 модулює фагоцитарну активність та рухливість макрофагів
  • Роль TRPM8 у макрофагах в контексті запалення
  • Обговорення
  • Методи
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткові легенди про фігури
  • Додаткові цифри
  • Додаткові методи

Предмети

  • Клітинна загибель та імунна відповідь
  • Коліт
  • Моноцити та макрофаги
  • Перехідні потенційні канали рецепторів

Резюме

Вступ

Що стосується макрофагів, то вже було показано, що кілька каналів TRP приймають сигнали, важливі для функції макрофагів. Наприклад, макрофаги з дефіцитом TRPC3 виявляли підвищений апоптоз та змінений ефероцитоз, 9 і підвищення рівня TRPC6 спостерігалося в альвеолярних макрофагах людини у пацієнтів із хронічною обструктивною хворобою легень. У перитонеальних макрофагах миші (ПМ) пов’язане з TRPV2 зв’язування з частинками та фагоцитоз були пов’язані з індукованою ліпополісахаридами (LPS) цитокінами, тоді як TRPV4 +/+ макрофаги відновлювали схильність легенів до TRPV4 -/- до механічних пошкоджень, спричинених вентилятором. 11, 12

Тут ми демонструємо, що активація конститутивно експресованого TRPM8 у мишачих макрофагах індукує протизапальний цитокіновий профіль та збільшує фагоцитоз, тоді як генетична делеція або фармакологічне блокування TRPM8 викликає протилежні ефекти. Відповідно до цих висновків, ментолові клізми захищали мишей дикого типу (WT) з експериментальним колітом, незалежно від модуляції вивільнення нейропептидів, тоді як у мишей з дефіцитом TRPM8 спостерігався загострений коліт. Миші, відновлені з дефіцитними TRPM8 макрофагами, постійно виявляли підвищену сприйнятливість до коліту, демонструючи критичну роль для конститутивної експресії TRPM8 у вродженому імунітеті. Встановлено, що прозапальні ефекти макрофагів з дефіцитом TRPM8 залежать від дисбалансу фактора некрозу пухлини α (TNF) -α та вироблення інтерлейкіну (IL) -10 in vitro та in vivo .

Результати

Функціональне вираження TRPM8 у популяціях макрофагів

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

TRPM8 модулює експресію цитокінів у макрофагах

TRPM8-опосередкована модуляція експресії цитокінів у перитонеальних макрофагах миші (ПМ). Вивільнення TNF-α ( до ) та ІЛ-10 ( b ) дикого типу (WT) та TRPM8-дефіцитного (KO) PM після 8 год стимуляції LPS (100 нг мл -1) без або без ментолу (100 мкМ). Активація TRPM8 інгібує TNF-α, але посилює вивільнення IL-10 у WT, але не дефіцитний TRPM8 PM. Дані беруться з трьох експериментів (середнє та семеро чотирьох мишей на генотип, проаналізовані у трьох примірниках. * P

Ментолові клізми захищають мишей дикого типу WT C57BL/6 від коліту DSS (2%). ( до ) Миші, які отримували ментолові клізми два рази на день (100 мкМ), лише втратили масу ваги під час перебігу коліту DSS порівняно з контролем транспортного засобу. Дані є репрезентативними для трьох експериментів, кожна група n = 6. * P 3, 5 Потім ми вимірюємо вивільнення CGRP із ізольованих товстих кишок здорових та колітичних мишей (додаткова фігура S5). Агоністи TRPM8 ментол (100 мкМ) та іцилін (33 мкМ) інгібували механічно індуковане вивільнення CGRP (90 мм рт. Цікаво, що вивільнення CGRP з товстої кишки, спричинене розтягненням запаленої товстої кишки (2% DSS-коліт), було суттєво послаблене, що свідчить про виснаження/десенсибілізацію пептидергічних сенсорних нейронів. Жоден з агоністів TRPM8 не виявляв впливу на механічно індуковане вивільнення CGRP за цієї умови.

Для подальшого вивчення загальної ролі TRPM8 у запаленні товстої кишки ми індукували DSS-коліт у мишей WT та TRPM8 KO. Як визначали ті самі скринінгові інструменти, що і раніше, миші TRPM8 KO виявляли підвищену сприйнятливість до коліту (малюнок 5). Порівняно з контрольними мишами WT, миші TRPM8 KO втратили більшу вагу (Малюнок 5а), і більша кількість нокаутованих мишей загинуло під час 7-денного курсу коліту DSS (Малюнок 5b). Миші TRPM8 KO також виявляли більші ендоскопічні пошкодження (рис. 5c) та більш серйозні гістологічні зміни (рис. 5d) порівняно з контрольними мишами WT.

Погіршений коліт DSS (2%) у мишей з дефіцитом TRPM8 (KO) порівняно з мишами дикого типу (WT). ( до ) Втрата ваги у мишей з дефіцитом TRPM8 була більш серйозною порівняно з контрольними мишами WT під час курсу коліту DSS в цьому окремому експерименті. Дані репрезентативні для трьох експериментів, кожна група n = 6. * P

Підводячи підсумок, наші висновки визначають TRPM8 як потенційну мішень при запальних станах, які, як правило, включають функцію макрофагів (наприклад, мікробні інфекції) і, зокрема, включають лікування запальних захворювань кишечника. Клінічні випробування із застосуванням клізм або пероральних препаратів агоністів TRPM8, таких як іцилін, ментол та евкаліптол, повинні бути простими, оскільки серйозних побічних ефектів із цими препаратами не повідомлялося. 42 Крім того, препарати на основі м’яти перцевої м’яти вже застосовуються пацієнтами із синдромом роздратованого кишечника через їх знеболюючу, спазмолітичну та ветрогонну дію; пацієнти із запальними захворюваннями кишечника також можуть отримати користь від цих наслідків.

Методи

Детальніше див. Додаткові методи.

Тварини. Мутант WT та TRPM8 (B6.129P2-Trpm8 tm1Jul/J, лабораторія Джексона, Бар-Харбор, штат Мен) 43 мишей C57BL/6 обох статей використовували у віці 8–12 тижнів. Всі експерименти на тваринах були схвалені Управлінням захисту тварин, урядовим урядом Міттельфранкен, Ансбах, Німеччина.

Виділення мишачого ПМ та макрофагів, отриманих з кісткового мозку. Детальніше про підготовку та ізоляцію клітин див. Додаткові методи. Як було описано раніше, процедури гарантували, що> 99% прикріплених клітин становили F4/80 + макрофаги. одинадцять

Аналіз фагоцитозу. Слідчий, який оцінив фагоцитарну активність у всіх групах, був засліплений щодо генотипів та процедур лікування. Фагоцитоз in vitro оцінювали за допомогою частинок зимозану або Citrobacter rodentium; in vivo для оцінки фагоцитозу використовували мікрочастинки флуоресбріта (0,5 мкл г -1; Polysciences, Еппельхайм, Німеччина).

Раціометричні [Ca 2+] i вимірювання. Раціометричні вимірювання [Ca 2+] i культивованих мишачих ПМ та BMDM з використанням фура-2 (5 мкмоль l -1), по суті, проводили, як було описано раніше щодо нейронів. 6 6

Індукція DSS коліту, моніторинг та фармакологічне лікування. Коліт індукували додаванням 2% DSS (молекулярна маса: 36 000–50 000 кДа; MP Biomedicals, Ілкірх, Франція) протягом 1 тижня, як описано раніше. 6 Оцінку ендоскопічного коліту проводили, як описано раніше, з використанням мишачого ендоскопічного індексу тяжкості коліту (ендоскопічний бал), що складається з п’яти параметрів: консистенція стільця, зернистість слизової оболонки, видимий ексудат фібрину, зміна судинного стінки та потовщення стінки товстої кишки, що супроводжується втрата прозорості. 44 Кожен параметр оцінювався від 0 балів (немає) до 3 балів (важкий).

Виснаження макрофагів in vivo, адоптивний перенос та відновлення. Спочатку цей метод був описаний Ван Роойеном та Сандерсом. Чотири. П’ять

Надмірна експресія IL-10 in vivo. Конструкція експресії для стійкої експресії IL-10 in vivo була створена шляхом клонування фрагмента комплементарної ДНК (кДНК), що кодує миша повної довжини кДНК у вірус AAV, як описано раніше. 46 ДНК було виділено за допомогою макси-наборів плазміди Qiagen, які включають етап видалення ендотоксину. Згодом ДНК обробляли набором для видалення ендотоксинів MiraClean (Mirus Bio, Madison, WI). Для лікування 10 мкг конструкції вводили в розчин Кребса - Рінгера кожній миші шляхом гідродинамічної ін’єкції хвостової вени, як описано раніше. 47 контрольних мишей отримували контрольну плазміду, що не кодує IL-10 (макет).

Виявлення активних форм кисню. Система сканування флуоресценції повного тіла MAESTRO (INTAS, Геттінген, Німеччина) була використана для мультиспектрального флуоресцентного аналізу in vivo, як описано нещодавно. 43 Виявлення АФК проводили з використанням барвника ROS Brite 700 нм відповідно до рекомендацій виробника (AAT Bioquest, Саннівейл, Каліфорнія).

Аналіз даних. Число (n) відноситься до кількості досліджених тварин або клітин. Розрахунки проводили за допомогою Statistica 7.0 (Statsoft, Tulsa, OK) та Origin 7.0 (OriginLab, Northampton, MA). Використані тести позначені в тексті та/або легендах рисунків.