Резюме
Доступ надано
Довіритель
Основні обмеження вірусних векторів, особливо ті, що стосуються безпеки та імуногенності, призвели до досліджень, спрямованих на вдосконалення методів невірусної доставки генів. 1 Серед таких невірусних векторів катіонні ліпосоми є однією з найбільш перспективних невірусних систем для використання в генній терапії. 2 Ефективна доставка функціональних терапевтичних генів у клітини-мішені є основною проблемою підходів до генної терапії для лікування раку та метаболічних захворювань, а також вірусної інфекції імунодефіциту людини.
Ми припускаємо, що електростатичної взаємодії катіонних ліпосом SG з ДНК було недостатньо для утворення комплексу ліпосом/ДНК з малим розміром частинок. Тому ми розробили високопозитивно заряджені ліпосоми невеликого розміру, які після змішування з водною фазою, що містить ДНК, можуть завантажуватися ДНК, в результаті чого утворюється невеликий комплекс ліпосом/ДНК. Для відбору печінки ми готуємо ліпосоми, що містять β-ситостерол β-D-глюкозид (Sit-G), який є основним компонентом SG (ліпосоми Sit-G). Для збільшення позитивного заряду в ліпосомах ми вибрали реагент Tfx-20 (Tfx) та 3β [N - (N ', N' -диметиламіноетан) -карбамоїл] холестерин (DC-Chol) як катіонні ліпіди, оскільки перший є синтетичне катіонне ліпідне з'єднання [[N, N, N ', N' -тетраметил-N, N '-біс (2-гідроксиетил) -2,3-ді (олеоїлокси) -1,4-бутандіамоній йодид], що проводить на високих рівнях Ефективність трансфекції в клітинних лініях 13 і останні вже клінічно використовуються для генної терапії. 14, 15 Для приготування невеликих ліпосом ми використовуємо модифікований метод введення етанолу.
У цьому дослідженні ми готуємо невеликі високопозитивно заряджені ліпосоми Sit-G, оптимізуємо співвідношення плазмідної ДНК, що кодує репортерний ген люциферази, до ліпосом Sit-G, оцінюючи ефективність трансфекції в клітинах HepG2 у присутності сироватки в середовищі та досліджували експресію генів комплексу Sit-G DNA/liposome після внутрішньовенного введення мишам.
Мікроскопічне спостереження показало, що ліпосоми Sit-G (78 ± 2 нм) з високим потенціалом 0,8 позитивних (33,8 ± 7,0 мВ) мають круглу форму (дані не показані). Суспензія ліпосом Sit-G була дуже стабільною і могла зберігатися протягом декількох місяців при 4 ° C без будь-яких змін у розмірі частинок (дані не наведені). Розмір частинок і потенціал комплексів ліпосом/ДНК Sit-G залежав від відношення заряду (+/-) катіонного ліпіду до ДНК (рис. 1). При відношенні заряду (+/-) приблизно 3, найбільший середній розмір частинок і дисперсія комплексу (1200 ± 247 нм) спостерігався, коли потенційний підхід наближався приблизно до нуля (0,1 ± 0,3 мВ). За винятком коефіцієнта заряду 3, розмір частинок комплексу ліпосома/ДНК знаходився в межах приблизно 100–250 нм.
Повнорозмірне зображення
Для оптимізації співвідношення ДНК до ліпосом Sit-G досліджували експресію репортерного гена в клітинах HepG2, трансфікованих ліпосомами Sit-G при різних коефіцієнтах навантаження (+/-) у середовищі з сироваткою або без неї (рис.2). Коефіцієнт навантаження (+/−), пов'язаний з вищою ефективністю трансфекції комплексу ліпосом/ДНК Sit-G, був змінений з 3 на 4 шляхом додавання 10% сироватки до середовища. Після інкубації протягом 1 год у середовищі, що містить сироватку, розмір частинок комплексу ліпосоми/Sit-G DNA при співвідношенні завантаження (+/−) 4 збільшився з 240 ± 16 нм до приблизно 3 мкм, а потенціал de зменшився з 27,9 ± 5,1 мВ до −8,9 ± 2,1 мВ. Різні компоненти сироватки, такі як бичачий сироватковий альбумін (BSA), гепарин, імуноглобулін G та ліпопротеїни, змінюють потенціал комплексу ліпосом/ДНК від позитивного до негативного або нейтрального. 16, 17 Отже, комплекс ліпосом/ДНК у сироватковому середовищі може вимагати надлишку позитивного заряду, що призводить до збільшення коефіцієнта заряду (+/-) для високої ефективності трансфекції від 3 до 4.
Експресія генів у клітинах HepG2, трансфікованих ліпосомами Sit-G, ліпосомами, що не належать до Sit-G, або комплексами Tfx/ДНК у середовищі з 10% сироваткою або без неї. Аликвоти 2 мкг плазмідної ДНК (pAAV-CMV-luc) складали з кожним типом частинок ліпосом або Tfx при співвідношенні заряду (+/-) 4 і 2 на лунку, відповідно. Комплекси Tfx/ДНК готували як контролі з ДНК і без неї при співвідношенні завантаження (+/-) 2 (2 мкг ДНК з 0,06 мг/мл загальних ліпідів, 0,015 мг/мл катіонних ліпідів відповідно), згідно виробники. Протокол (Promega). Ліпосоми Non-Sit-G, що складаються з Tfx/DC-Chol (1,3/2, вагове співвідношення), отримували модифікованим методом введення етанолу, як описано в легенді на малюнку 1. Інші експериментальні умови були ідентичними умовам, описаним у легенді про Рисунок 2. Кожен стовпець представляє середнє значення ± SD (n = 3). *** П
Залежність дози експресії гена через 24 год після внутрішньовенного введення ліпосоми Sit-G, комплексованої з плазмідною ДНК, мишам. Співвідношення заряду (+/-) катіонного ліпіду до плазмідної ДНК (pAAV-CMV-luc) становило 4. Експериментальний протокол був ідентичним тому, що описаний у легенді на малюнку 4. Кожна колонка являє собою середнє значення ± SD (n = 4 ). (□) 30 мкг ДНК; (▪) 50 мкг ДНК; (░) 100 мкг ДНК.
Повнорозмірне зображення
Здається, ліпосоми Sit-G є потенційно корисними векторами для націлювання на печінку, які демонструють ефективність, подібну до ефективності галактозильного ліганду, хоча необхідно пояснити, чи є селективна експресія генів у печінці для клітин паренхіми або непаренхіму. Через двадцять чотири години після внутрішньовенного введення комплексу ліпосом/ДНК, що не є Sit-G, у дозі 50 мкг ДНК, одна з п’яти мишей померла. Це могло бути пов'язано з токсичністю, спричиненою агрегатами комплексу в сироватці крові, як передбачається спостереженням, що ліпосома/ДНК-комплекс, що не є Sit-G, була більшою, ніж комплекс ліпосом/ДНК Sit-G у середовищі, що містить сироватку (Рисунок 6 ). Цей висновок припустив, що додавання Sit-G до ліпосом може призвести до хорошої дисперсії комплексу ліпосом/ДНК у сироватці крові.
Скануючі електронні мікрофотографії комплексів ДНК/ліпосоми Sit-G (a) та комплексів ДНК/ліпосом не-Sit-G (b) після інкубації протягом 1 години з 10% середовищем сироватки. Співвідношення заряду (+/-) катіонного ліпіду в ліпосомах до плазмідної ДНК (pAAV-CMV-luc) становило 4. Плазмідну ДНК (2 мкг) змішували та інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з ліпосомами у воді, а потім протягом 1 год у середовищі з 10% сироватки при 37 ° C. Метод, що використовується для візуалізації комплексів ліпосом/ДНК, адаптований від Sternberg et al. Коротко, 10 мкл аліквот свіжоприготовлених зразків поміщали на мідну платформу і покривали покривним склом, на якому формувався один шар комплексу ліпосом/ДНК. Шар заморожували і сушили. Після видалення покривного скла, шар ліпосом/ДНК на мідній платформі був покритий золотом та розглянутий за допомогою скануючого електронного мікроскопа (SEM) (JSM-T200; JEOL, Токіо, Японія).
Повнорозмірне зображення
На закінчення ми успішно підготували невеликі комплекси Sit-G-ліпосоми/ДНК діаметром приблизно 200 нм при рН 7 для доставки генів, націлених на печінку. Комплекс Sit-G-ліпосом/ДНК суттєво підвищив ефективність трансфекції в клітинах HepG2 при співвідношенні завантаження (+/-) 4 з додаванням 10% сироватки до середовища, що вказує на селективну експресію гена в печінці після внутрішньовенного введення мишам. що взаємодія комплексів ліпосом/ДНК із сироваткою може бути ключовим моментом при прогнозуванні ефективності in vivo ліпосомного вектора.
Sit-G ліпосоми будуть корисні як вектори для доставки печінкових генів шляхом подальших посилень, таких як додавання фузогенного пептиду до ліпосоми для збільшення вивільнення складної ДНК у цитозоль та оптимізації умов для утворення комплексу та дози ліпідів.
Висловлення подяки
Ми хотіли б подякувати професору Т. Цудзі та його дослідницькій групі кафедри мікробіології Університету Хоші за допомогу у підготовці плазмід, а також доценту Дж. Камею та його дослідницькій групі кафедри фармакології Університету Хоші за допомогу в аналіз на люциферазу. Також ми хотіли б подякувати доктору Дж. Вану за допомогу в експериментальній роботі. Ця робота була частково підтримана Токійським фондом Нагай та грантом на наукові дослідження від Міністерства освіти, науки, спорту та культури, Японія, 12672210.