Підвищення розчинності біологічно активних пептидів з похідними олігоетиленгліколю Докторська дисертація Адам Бартос Наукові керівники: д-р Каталін Урай д-р Ференц Худеч MTA-ELTE Група досліджень пептидної хімії ELTE Відділ органічної хімії ELTE-TTK Докторська школа хімії Керівник: Інцельт Дьєр Програма синтетичної хімії, матеріалознавства, біомолекулярної хімії Керівник програми: Іштван Тамас Горват, д.т.н. 2008. 1
Подяка, яку я хотів би подякувати: д-р Міклош Холлоші, д-р Андраш Перчель, завідувач кафедри, за те, що дозволив мені працювати в кафедрі органічної хімії Університету Етвеша Лорана, мої керівники, д-р Ференц Худеч, науковий керівник, керівник групи з хімії пептидів MTA і д-р Урай, д-р Хедвіг Меджиградський та д-р Сільвія Бше для аналітичних досліджень, д-р Гітта Шлоссер для ідентифікації дослідників за допомогою мас-спектрометрії, Ката Горвати для мас-спектрометрії та К. Ласло Кочіс за корисні поради та підтримку. Я хотів би подякувати докторській школі університету Етвеша Лоранда за те, що моя докторська робота стала можливою, а наступні фінансові ресурси дозволили мені виконувати докторську роботу: TKA o K61518 05- 0183/3.0 GVP-3 .2.1-2004-04-0005/3.0. Дякую моїм батькам, моїй родині Ріті за їх терпіння та спокійний досвід, який вони мені допомагали протягом докторської роботи. 2
Список скорочень Я використовував абревіатури з 1 та 3 букв, що використовуються в літературі, для скорочення амінокислот (1). AAA AUC Boc BP Bzl CoA CM Зона аналізу амінокислот під кривою t-бутилоксикарбонілбензотріазол-1-ілокситрис (диметиламіно) фосфоній гексафторфосфат бензил коензим із загальним середовищем CP HC (Acm) VVVDVSHEDDCcHD-DCMHCD-DC2HCM-DC2HCM-DC2HCM-DHCD-DCH-DCM дициклогексилсечовина DIC, -діізопропілкарбодіімід DIEA, -діізопропілетиламін DMAP 4-диметиламінопіридин DMF, -диметилформамід DMS диметилсульфоксид DMS диметилсульфоксид ED H-EVV -діамін EDT 1,2-етаноловий етиловий спирт етиловий етилацетат етиловий спирт етиловий етилацетат етилацетат етилацетат етиловий спирт етиловий етиловий спирт етиловий етилацетат етилацетат етилацетат етилацетат етилацетат етилацетат етилацетат етиловий спирт спектрометрія Fc-фрагмент, що кристалізується, константа антитіла, константна область Fmoc 9-флуоренилметоксикарбоніл 3
Fmoc-su HF HBt HPcp ВЕРХ IC 50 ICM IgG MBHA MS MeH MTT HS MP Pcp PBMC PEG PyBP tbu TEG TFA TFMSA TTD TTD-Su 9-флуоренілметоксикарбоніл - оксисукцинімід фторид водню 1-гідроксибензтриазол гідрофторохлорофенол пентахлорофенол концентрація мозку 50% -ве пригнічення бессивороточной середовищі імуноглобуліну G 4-метілбензгідріламіновой мас - спектрометричного смоли метанолу 3- (4,5-діметілтіазол-2-іл) -2,5-діфенілтетразолійбромід bromidehydroxysuccinimidonpyrimenimyrpyrimimethylpyrimidylpyrimidylpyrimidylpyrimyrimethylpyrimidylpyrimidylpyrimidylmethylpyrr ефіру периферичної крові мононуклеарних клітин мононуклеарів периферичної поліетилен гліколь клітин бензотриазол-1 илокситрипиролидинофосфоний гексафторфосфат трет-бутил 3,6,9-триоксандекан-1,11-дикарбонова кислота трифторуксусна кислота трифторметансульфокислота 4,7,10 аміно-4,7,10-триокса-1,13-тридеканамід янтарна кислота VP H-VVDVVS H 2 Z бензилоксикарбоніл 4
Зміст 1. Вступ 8 2. Огляд літератури 10 2.1. Полі- та олігоетиленгліколі 10 2.2. Взаємодія та використання авідину з біотином 12 2.3. Білки імуноглобуліну G 15 2.4. Твердофазний синтез пептиду 17 2.4.1. Історичний огляд 17 2.4.2. Смоли 19 2.4.3. Будова пептидного ланцюга 21 2.4.4. Захисні групи бічного ланцюга 22 2.4.5. Методи утворення пептидного зв’язку 23 2.4.6. Відстеження з’єднань 25 2.4.7. Відщеплення пептидів від смоли 26 2.4.8. Очищення та ідентифікація пептидів 27 3. Завдання та стратегія 28 4. Результати 31 4.1. Результати синтезу пептидів CP та VP 31 4.2. Результати синтезу пептидного ЕД 34 4.3 Похідні лігоетиленгліколю 35 4.3.1 Прокладки на основі 3,6,9-триоксандекан-1,11-дикарбонової кислоти (ТЕГ) 36 4.3.1.1. Окислення тетраетиленгліколю 37 4.3.1.2 Гетерогенне фазове окислення тетраетиленгліколю 37 4.3.1.3. Асиметричний захист 3,6,9-триоксандекан-1,11-дикарбонової кислоти (ТЕГ) 38 4.3.1.4. Приготування моно-Boc етилендіаміну (Boc-EDA) та моно-fmoc етилендіаміну (Fmoc-EDA) 40 4.3.1.5. Синтез захищених розпірок на основі EDA-TEG у розчині 41 4.3.2. Проставки на основі 4,7,10-триокса-1,13-тридекандіаміну (TTD) 42 4.3.2.1. Створення двійкової іонної структури 43 4.3.2.2. Розробка захисту від Boc та Fmoc на розпірній системі TTD-Su 45 4.3.2.3. Утворення активного ефіру 46 4.3.2.4. Підключення розпірок на основі TTD 47 5
6.4.2.3. Кон'югація біотину-EDA-TEG з пептидом ED 86 6.4.2.4. Приготування кон’югату біотин-EDA-TEG-ED з використанням Fmoc-EDA-TEG 86 6.4.3. 6.4.3.1. Біотинільовані кон’югати на основі TTD. Приготування біотину-TTD-Su у розчині 87 6.4.3.2 . Синтез біотину (TTD-Su) n (n = 1,2,3) на твердій фазі із стратегією Boc 88 6.4.3.3. Синтез біотину (TTD-Su) n (n = 1,2,3) на твердій фазі за стратегією Fmoc 89 6.4.3.4. Кон'югація біотину (TTD-Su) n (n = 1,2,3) з пептидами CP і VP 90 6.4.3.5. Структура біотину (TTD-Su) n (n = 1,2,3) на пептидах CP та VP за стратегією Fmoc 90 6.4.3.6. Структура біотину (TTD-Su) n (n = 1,2,3) на пептидах CP та VP за стратегією Boc 91 6.5. Аналітичні методи 92 6.5.1. Моніторинг реакцій зчеплення та розщеплення 92 6.5.2. Аналіз ВЕРХ 93 6.5.3. Аналіз амінокислот 94 6.5.4. Мас-спектрометрія 94 6.6. тести на розчинність 95 6.6.1. Вимірювання розчинності методом ВЕРХ 95 6.6.2. Вимірювання читабельності шляхом вимірювання маси 96 6.7. Дослідження цитотоксичності 97 6.7.1. Підготовка PBMC 97 6.7.2. Визначення цитотоксичності спейсера за допомогою колориметричного тесту на тетразолій (МТТ) 97 7. Список літератури 99 Резюме 104 Резюме 105 7
Моя докторська дисертація складається з синтезу пептидів, приготування гідрофільних спейсерів, синтезу біотинвмісних кон’югатів та їх дослідження. Для цього я підготував гідрофобну послідовність IgG людини та її коротший варіант, біотинільовані форми яких використовуються в аналізах ІФА (6). Два олігоетиленгліколі використовувались як вихідні речовини для приготування гідрофільних прокладок, один на основі дикарбонової кислоти (3,6,9-триоксандекан-1,11-дикарбонової кислоти, ТЕГ) і один на основі діаміну (4,7,10- триокса-1,13-тридекандіамін, TTD). олігоетиленгліколь Вставлення розпірних елементів олігоетиленгліколю між біотином та пептидом збільшує розчинність кон'югату. Розчинність отриманих кон'югатів перевіряли двома методами. Ми також дослідили, чи отриманий спейсер має цитотоксичну дію, оскільки це є важливим фактором для подальшої застосовності (наприклад, розчинення ліків). 9
Авідін є глікопротеїновим компонентом яєчного білка, 0,05% від загального вмісту білка. Гомотетрамер вагою 66 кда може зв’язувати до 4 біотинів. Біотин незворотно зв’язується, тим самим перешкоджаючи всмоктуванню біотину в шлунково-кишковому тракті. споживання більше 20 штук сирого яєчного білка на день викликає симптоми дефіциту. З його денатурацією він втрачає здатність зв’язувати біотин. Взаємодія між авідіном та біотином (рис. 3) (KD = 1,3x10–15 М) є найсильнішою нековалентною взаємодією, відомою на сьогоднішній день у біологічних системах, витримуючи екстремальні значення рН, протеази та деякі процеси денатурації (18) . Рисунок 3: Амінокислоти, що беруть участь у взаємодії авідин-біотин 13
Взаємодія авідин-біотин вперше була використана Хайцманом та Річардсом для афінної цитохімії (19). У 1976 р. Байєр, Вільчек та Скутельський використовували біотинільовані антитіла для локалізації рецепторів, а також біотинільовані антигени на мембранах еритроцитів (20). Багато методів біологічного зв'язування засновані на вивченні зв'язування пептидного рецептора або пептидного антитіла. Для цього тестований пептид часто маркують біотином (21, 22), який прив’язаний до покритої плівкою стрептавідину. Цей метод має два недоліки. Одне з них полягає в тому, що біотин зв’язується безпосередньо з пептидом, що може впливати на аналізи зв’язування. У цьому випадку використовується спейсер, довшеланцюгове похідне біотину, таке як біотиніл-6-аміногексанова кислота (рис. 4). Іншим недоліком цього методу є те, що його важко застосовувати до пептидів, які не є або погано розчиняються у воді, оскільки приєднання біотину до пептиду додатково знижує розчинність у воді, і дослідження проводяться в гідрофільному середовищі. Розчинність біотину у воді становить 0,22 мг/мл, а в 95% етиловому спирті - 0,80 мг/мл. H H S H H Рисунок 4: Біотиніл-6-аміногексанова кислота 14
молекула для зв'язування з Fc-рецепторами в різних клітинах, що призводить, наприклад, до активації В-клітин. Sondermann et al. (23) використовували рентгенівську дифракцію, щоб визначити, які частини Fc-області IgG беруть участь у зв'язуванні Fc-рецепторів. Спільне дослідження нашої дослідницької групи та кафедри імунології Університету Етвеша Лорана частково підтвердило роль цих пептидних сегментів у зв'язуванні (6). 16
H Полімерна смола Ванга Fmoc le Rink-амід-MBHA смола Полімер Cl Полімер Merrifield смола H 2 MBHA смола Полімер Рисунок 5: Будова використовуваних підкладок 20
R-CH + ipr- = c = -ipr DCM/DMF ipr-h R ipr H DCM/DMF R + ipr-h H-iPr H 2 -R 'DCM/DMF R HR' Рисунок 6: Механізм перемикання DIC/HBt RC - HDIEA + + (Me 2) 3 P + PF- 6 DCM/DMF RCP - - (Me 2) 3 PF 6 - HRH 2 -R 'DCM/DMF R HR' Рисунок 7: Механізм перемикання BP/HBt 24
1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 A 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0-0,2 0 10 20 30 40 час (хвилини) Рисунок 10: За стратегією Boc Аналітична RP-HPLC хроматограма неочищеного пептиду VP, приготовлена 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 A 0,2 0,1 0,0-0,1 -0,2 0 10 20 30 40 час (хв) Рисунок 11: Аналітична хроматограма ВР-ВЕРХ сирого пептиду CP, отримана за стратегією Boc 32
1,4 1,2 1,0 0,8 A 0,6 0,4 0,2 0,0-0,2 0 10 20 30 40 час (хвилини) Рисунок 12: Аналітична RP-HPLC хроматограма неочищеного пептиду VP, приготована за стратегією Fmoc 0,8 0,7 0,6 0,5 A 0, 4 0,3 0,2 0,1 0,0-0,1 0 10 20 30 40 час (хв) Малюнок 13: Аналітична RP-HPLC хроматограма неочищеного пептиду CP, приготовлена за стратегією Fmoc 33