пілотне

  • предметів
  • реферат
  • Передумови:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • Головний
  • Матеріали і методи
  • Етичні аспекти
  • Відбір і відбір проб пацієнта
  • Перевірка
  • Вимірювання стільця MMP-9
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Перевірка
  • Калові рівні MMP-9 між групами
  • Калові рівні MMP-9 за місцем знаходження та стадією CRC
  • обговорення
  • Історія змін

предметів

  • Колоректальний рак
  • Діагностичні відмітки
  • гідролаза

Ця стаття оновлена

реферат

Передумови:

Колоректальний рак (КРР) є однією з провідних злоякісних пухлин у світі, і дешеві, недорогі та неінвазивні методи скринінгу дуже важливі. Матриця металопротеїнази-9 (ММР-9) відіграє певну роль у прогресуванні CRC, і її рівень підвищений у біоптатах пухлини. Рівні MMP-9 у фекаліях підвищені у активних пацієнтів з виразковим колітом, але ніколи не вимірювались у пацієнтів з CRC. Ми зосередились на визначенні рівнів MMP-9 в калі у пацієнтів, які проходять загальну колоноскопію згідно з ендоскопічним та гістологічним діагнозом.

методи:

Сто дев'ять пацієнтів надали зразки калу для аналізу MMP-9. Проведена загальна колоноскопія; підозрілі ураження оцінювали за гістологією. Рівні калу MMP-9 вимірювали методом ІФА.

результати:

Кількість пацієнтів, розділених на різні групи, була: негативна/дивертикулярна: 34 (називається контрольною); гіперпластичні поліпи: 15; аденоми: 32 (22 з високим ризиком); та CRC: 28. Фекальний MMP-9 був значно підвищений у CRC порівняно з усіма іншими групами (P 400 000 нових випадків на рік (Ferlay et al, 2013).) Висока частота захворювання та той факт, що прогноз добре корелює з стадія діагностики робить колоноскопію золотим стандартом для проведення скринінгового дослідження через високу чутливість та специфічність, але вона також має такі недоліки, як ризик ускладнень, великі витрати та нижча прийнятність пацієнта як скринінговий метод, тому неінвазивні методи необхідний для виявлення пацієнтів із високим ризиком ХРН, де необхідно провести колоноскопію.

Матричні металопротеїнази (ММР) - це сімейство Zn 2+, що містять ендопептидази, що секретуються різними типами клітин, такими як пухлинні клітини, мезенхімальні клітини, фібробласти та запальні клітини, такі як моноцити, лімфоцити та нейтрофіли. Підвищена експресія MMP-9 була виявлена ​​у зразках тканин раку прямої кишки та раку товстої кишки, де це корелює з поганим прогнозом (Unsal et al., 2008; Araujo et al., 2015; Yang et al., 2014). Нещодавно ми показали, що рівень MMP-9 у калі підвищений у пацієнтів з активним виразковим колітом (UC) порівняно з пацієнтами з функціональним розладом шлунково-кишкового тракту (синдром роздратованого кишечника з переважною діареєю) або здоровим контролем (Annahazi et al, 2013). Встановлено, що рівні фекального ММР-9 є предиктором активності захворювання у пацієнтів з НК (Annahazi et al., 2013) і мають високу специфічність у діагностиці пухіту (Farkas et al., 2014). Однак рівні фекалій ММР-9 у пацієнтів з ХРН не вивчались.

Виходячи з цього, ми зосередились на вимірюванні рівня MMP-9 в калі у пацієнтів, які проходять колоноскопічне обстеження в нашій лікарні, та на аналізі результатів за різними колоноскопічними та гістологічними висновками.

Матеріали і методи

Етичні аспекти

Протокол дослідження був затверджений Комітетом з етики Сегедського університету в Сегеді, Угорщина. Усі організації надали письмову та інформовану згоду на участь.

Відбір і відбір проб пацієнта

Загалом у нашому дослідженні було залучено 109 пацієнтів (чоловіки/жінки: 58/51, вік: 29-91 рік, середні показники: 66,0 років), які були зараховані до нашого спеціалізованого колоректального відділення в першому медичному відділенні в Сегеді, Угорщина, кому вони зробили колоноскопію для всіх. Жоден пацієнт не мав історії UC та інших видів раку. У одного пацієнта, у якого пізніше було виявлено аденокарциному прямої кишки, були метастази в печінку. Зразки стільця відбирали у всіх пацієнтів за 2-4 дні до колоноскопії та заморожували при -20 ° C протягом 1 години після дефекації. Всі колоноскопії були завершені до досягнення кінцевої клубової кишки. Під час колоноскопії з усіх підозр на ураження брали біопсію та проводили гістологію. На основі колоноскопічних та гістологічних результатів пацієнти були розділені на п’ять груп: негативні, дивертикульоз, гіперпластичний поліп, аденома та CRC. Вважалося, що аденоми мають підвищений ризик злоякісної пухлини, коли було дотримано одну з наступних умов: розмір поліпа> 10 мм; ворсинчаста аденома або тубульовільозна аденома з щонайменше 20% компонентом ворсинок; високоякісна дисплазія; або множинна аденома (> 3).

Перевірка

Наша група першою застосувала комерційний імуноаналіз на кількісні ферменти людини від R&D Systems (Abingdon, UK, Cat. No. DMP900) для вимірювання рівня ММР-9 в калі. Тому ми провели перевірочний тест, щоб перевірити, чи впливає сама фекальна матриця на визначення ММР-9 та чи здатний набір від R&D Systems визначати ММР-9 з фекальних екстрактів людини.

Активний людський повноцінний білок MMP-9 (Abcam LTD, Кембридж, Великобританія; кат. №: ab157344; No партії: GR218764-1) додавали до екстракційного середовища. Контрольні зразки фекалій зважували і вводили 1 мл екстракційного середовища з додаванням ММР-9 або без нього 0,25 мг зразка (співвідношення зразка до екстракційного середовища становило 1: 4). Зразки негайно гомогенізували протягом 2 х 30 с і інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Згодом усі гомогенати центрифугували при 1500 g протягом 10 хвилин, після чого проводиться друге центрифугування супернатантів з першого етапу центрифугування при 10000 g протягом 10 хвилин. Кінцеві супернатанти обробляли для тесту на лінійність (паралельність). Екстракт, що містить доданий MMP-9, послідовно розводили 1 + 1, отримуючи 50, 25, 12, 5 і 6, 25% вихідного вмісту MMP-9 з екстрактом з тих же калів, які не містили доданого MMP- 9. Потім усі зразки, включаючи 100% доданий екстракт ММР-9 та природний контрольний екстракт без додавання ММР-9, піддавали вимірюванню ММР-9 за допомогою згаданого набору ІФА для ММР-9 людини. Цей набір здатний виявляти 92-кДа людини Pro-MMP-9 та 82 кДа активної форми ММР-9, як описано виробником. Доданий білок MMP-9, отриманий для цієї оцінки, становив 92 кДа Pro-MMP-9.

Вимірювання стільця MMP-9

Зразки зберігали при -20 ° C максимум 3 місяці, а потім давали їм розтанути при 4 ° C протягом 1 доби. Всього 1,0 г кожного зразка калу розбавляли, змішували та гомогенізували в 4 мл крижаного трис-буфера (0,15 М NaCl + 20 м М Трис-HCl, рН: 8,3). Після центрифугування (10 хвилин, 4500 об/хв, 4 ° C) гранули видаляли, а супернатанти нещодавно центрифугували (10 хвилин, 10 000 г; 4 ° C). Кінцеві супернатанти фільтрували за допомогою шприцевих фільтрів 0,8 мкм з розміром пор і аліквоти зберігали при -20 ° C до аналізу. ММР-9 вимірювали за допомогою кількісного імуноферментного аналізу, описаного вище.

Статистичний аналіз

Безперервні дані були представлені як середнє значення ± sd тесту Крускала-Уолліса, який використовувався для порівняння рівнів фекалій MMP-9 у різних групах (контроль, гіперпластичний поліп, аденома та CRC). Рівні MMP-9 підгруп аденоми високого та низького ризику аналізували за допомогою тесту Манна-Уітні. Різні підгрупи за місцем розташування пухлини або стадією порівнювали з тестом Крускала-Уолліса. Відмінності вважали статистично значущими, коли Р 0, 8 (Бейкер і Крамер, 2007). Порогове значення визначалося максимальним значенням індексу Юдена (чутливість + специфічність - 1). Статистичний аналіз проводили із застосуванням статистичного програмного забезпечення R (версія 3.1.2) (//www.r-project.org/).

результат

Перевірка

Концентрації, виміряні в нг мл -1, показані на малюнку 1. На рисунку чітко видно лінійну зміну концентрації, що відповідає розведенню. Тобто, (i) фекальний матрикс сам по собі не впливає на визначення ММР-9; та (ii) набір від R&D Systems здатний визначати MMP-9 на основі екстрактів фекалій людини.

Рівні концентрації MMP-9 при різних розведеннях у валідаційному аналізі.

Повнорозмірне зображення

Калові рівні MMP-9 між групами

Калові рівні ММП-9 різних груп (на основі колоноскопії та гістології). Абревіатура: CRC = колоректальний рак.

Повнорозмірне зображення

ROC CRC проти контрольної кривої.

Повнорозмірне зображення

Калові рівні MMP-9 в аденонах.

Повнорозмірне зображення

Калові рівні MMP-9 за місцем знаходження та стадією CRC

Кількість пацієнтів для ділянки CRC була наступною: пряма кишка: 14, сигмовидної кишки: 6, лінійна згинання: 1, поперечна товста кишка: 2, згинання печінки: 2, висхідна товста кишка: 1, та кишкова кишка: 2 пацієнти. Коли аналізували рівні MMP-9 у фекаліях за сайтом CRC, суттєвої різниці не спостерігалося (P = 0, 146), хоча тенденція до вищих рівнів спостерігалася для пухлини прямої кишки (середнє значення: 12, 33 ± 7, 274 нг мл - 1 ) порівняно з лівою товстою кишкою (товста кишка-флексо-сигмовидної кишки; середнє значення: 1619 ± 0,978 нг мл -1) та поперечною правою товстою кишкою (від сліпої кишки до поперечної ободової кишки; середнє значення: 1830 ± 0,656 нг мл −1; 5А). Згідно з класифікацією Дюка, між групами не спостерігалося суттєвої різниці (Рисунок 5B; P = 0,236).

Рівні випорожнень MMP-9 у пацієнтів з CRC. Значення за ( A ) розташування та ( B ) Етапи герцогів КПР.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Наскільки нам відомо, ми вперше повідомляємо, що рівні ММП-9 підвищені у зразках калу у пацієнтів із ХРН порівняно з пацієнтами без поліпоїдних уражень. Крім того, фекальний MMP-9 може бути використаний для розрізнення пацієнтів з ХРН від пацієнтів без поліпоїдних уражень з високою чутливістю та специфічністю. Крім того, фекальний MMP-9 здатний ідентифікувати майже 60% пацієнтів з аденомою високого ризику з нижчим рівнем відсікання.

Ми не виявили суттєвої різниці між рівнями MMP-9 у калі в групах з різним розташуванням пухлини. Однак у пацієнтів з аденокарциномою прямої кишки може спостерігатися тенденція до найвищих рівнів MMP-9 у фекаліях. Це, ймовірно, не пов'язано з природою пухлин прямої кишки, але це можна пояснити меншим часом деградації маркерів у просвіті кишки, подібним до FIT (Morikawa et al., 2005).

Тим не менше, наше дослідження було придатним для ідентифікації нового маркера, калу MMP-9, який здатний відрізнити CRC від контролю без поліпів. Фекальний MMP-9 характеризується багатьма перевагами FIT, а також молекулярними маркерами без великих витрат. Потрібні подальші дослідження на більшій та більш загальній популяції, щоб підтвердити, чи придатний цей перспективний метод для скринінгу CRC як додатковий тест.

Історія змін

Ця робота публікується на основі стандартної ліцензії на публікацію контракту. Через 12 місяців робота стає вільно доступною, а умови ліцензії переходять на непублічну ліцензію Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0.