c609t

  • реферат
  • Головний
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Групи пацієнтів
  • Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР)
  • Аналіз поліморфізму довжини фрагмента обмеження
  • Статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Характеристики населення
  • Частота генотипів та АБО
  • ОБГОВОРЕННЯ

реферат

Мета: Роль генетичної сприйнятливості до аденокарциноми стравоходу та її попередника ураження стравоходу Барретта не з’ясована до кінця. У цьому дослідженні досліджено вплив поліморфізмів на гени супероксиддисмутази марганцю (MnSOD) та NAD (P) H: хінон оксидоредуктази 1 (NQO1) на модуляцію ризику розвитку стравоходу Баррета або аденокарциноми стравоходу.

Методи: Загалом 584 пацієнта (146 стравоходу, 200 стравоходу Баретта, 144 стравоходу аденокарциноми та 94 контролі) були генотиповані для поліморфізмів MnSOD C14T та NQ01 C609T методом полімеразної ланцюгової реакції та аналізу поліморфізму довжини фрагментів рестрикції.

Результати: Генотип NQO1 TT був менш поширеним у пацієнтів із стравоходом Барретта (2,0%) та аденокарциномою стравоходу (1,4%) порівняно з пацієнтами з стравоходом (7,6%) та контролем (5,4%). Після корекції статі, віку, індексу маси тіла, симптомів рефлюксу та куріння у пацієнтів з гомозиготним генотипом TT 4 ризик розвитку стравоходу Барретта зменшився у 5,5 разів (ймовірність = 0,22, 95% довірчий інтервал = 0,07-0,76, P = 0, 01) та у 6, 2 рази знижений ризик аденокарциноми стравоходу (коефіцієнт ймовірності = 0,16, 95% довірчі інтервали = 0, 03–0,94, Р = 0,04) порівняно з особами з генотипами ТС та СС. Істотних відмінностей між групами для поліморфізму MnSOD не спостерігалось (P = 0,289).

Висновки: Загалом, результати цього дослідження дозволяють припустити, що генотип NQO1 TT може забезпечити захист від ускладнень рефлюксу, таких як стравохід Баррета та аденокарцинома стравоходу.

Головний

Більшість аденокарцином стравоходу (ЕАК) виникають як остання стадія багатоступеневого шляху, що починається з метапластичної зміни сегмента слизової оболонки стравоходу, захворювання, відомого як стравохід Барретта (BE). 1 У цій передозлоякісній фазі плюристратифікований епітелій стравоходу набуває кишкоподібних стовпчастих характеристик, включаючи наявність келихоподібних клітин. 2 Протягом останніх 30 років у багатьох епідеміологічних дослідженнях було виявлено причинно-наслідковий зв’язок між шлунково-стравохідною рефлюксною хворобою (ГЕРХ) та розвитком БЕ та ЕАК, причому ризик зростає у осіб з найвищим ступенем тяжкості, тривалості та частоти рефлюксу. 3, 4 Незважаючи на чіткий зв'язок між рефлюксом та ризиком розвитку ВЕ та ЕАК, лише у меншості пацієнтів з ГЕРХ розвиваються ускладнення, пов'язані з рефлюксом, і лише 0,5% пацієнтів із ВЕ щороку переносять рак. Поки що причини цієї неоднорідності у відповідь на рефлюкс потребують з'ясування.

З огляду на цей мутагенний рефлюксний потенціал, неоднорідність результатів ГЕРХ та ВЕ може бути пов’язана з індивідуальними варіаціями шляхів антиоксидантів, детоксикації та відновлення ДНК, що може вплинути на ризик отримання генетичних змін, що спостерігаються при прогресуванні ВЕ до злоякісної пухлини. вивчили зв'язок між специфічними генетичними поліморфізмами та плоскоклітинним раком стравоходу в азіатських популяціях високого ризику. 15-19 Однак на сьогоднішній день опубліковано лише кілька звітів про генетичну сприйнятливість до EAC у західних країнах; роль генетичної сприйнятливості до ВЕ дедалі більше розглядається.

У цьому дослідженні ми досліджували роль генетичних поліморфізмів у супероксиддисмутазах марганцю (MnSOD) та NAD (P) H: хінон-оксидоредуктаза 1 (NQO1) у модуляції сприйнятливості до BE та EAC у популяції Великобританії. Для досліджень було обрано MnSOD, оскільки цей фермент забезпечує важливий антиоксидантний захист від супероксидних аніонів, що утворюються під час запальних процесів. 8, 20 Поліморфізм MnSOD C14T призводить до зміни амінокислоти аланіну (алель С) до валіну (алель Т) в сигнальному пептиді, відповідальному за транспортування зрілого білка до правильного субклітинного ділянки 21, 22 і пов'язаний зі сприйнятливістю до різні ракові захворювання. 23-27 Дезінтоксикаційний фермент фази II NQO1 був обраний, оскільки він реагує з низкою природних та синтетичних сполук, включаючи хінони, епоксиди хінонів, хіноніміни, нафтохінони, метиленовий синій, азо та нітросполуки 28, і, отже, може метаболізувати широкий спектр канцерогени, що містяться при рефлюксі. Генотип ТТ відповідає нульовому фенотипу, оскільки він призводить до вироблення мутованого білка зі зниженою активністю та тривалим періодом напіввиведення. 29 Попередні дослідження показали зв'язок між цим поліморфізмом та низкою видів раку, включаючи злоякісні пухлини шлунково-стравохідної системи. 30, 31

Результати нашого дослідження дозволяють припустити, що поліморфізм NQ01 C609T може модулювати ймовірність того, що у пацієнтів з гастроезофагеальним рефлюксом розвиваються ВЕ та ЕАЦ, тоді як не виявлено зв'язку між поліморфізмом MnSOD C14T та ризиком цих захворювань.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Групи пацієнтів

Після поінформованої згоди загалом 584 пацієнти потрапили до лікарні Йоркширу, Великобританія, у спеціалізовану диспепсичну клініку та клініку ендоскопії Баретта двох вищих довідкових центрів (Королівська лікарня Халламшир, Загальна лікарня Шеффілда та Лідса, Лідс) у період з 2000 по 2003 рік. При прийомі на роботу збирали інформацію про вік, стать, симптоми рефлюксу, індекс маси тіла (ІМТ), історію куріння, вживання алкоголю та ліки. ДНК витягували з крові (n = 470) або звичайних зразків біопсії стравоходу (n = 114), використовуючи метод фенол/етанол або набір TriReagent (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, UK).

Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР)

Генотипування поліморфізмів NQ01 C609T та MnSOD C14T проводили методом ПЛР та аналізу поліморфізму фрагментів обмеженої довжини, як описано раніше, 23, 30 з незначними модифікаціями. Коротко, 1 мкл ДНК ампліфікували 1x PCR-буфером (Qiagen Ltd., Кроулі, Великобританія), 12,5 пмоль прямого та зворотного праймерів (InVitrogen Ltd., Пейслі, Великобританія), 0,5 одиниці HotStarTaq ДНК-полімерази (Qiagen Ltd.) та 200 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфату (InVitrogen Ltd.), загальним обсягом 20 мкл, з використанням термоциклера GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Warrington, UK). Послідовності праймерів були 5'aagcccagaccaacttct3 'і 5'atttgaattcgggcgtctgctg3' для NQ01 і 5'accagcaggcagctggcgccgg3 'і 5'gcgttgatgtgaggttccag3' для MnSOD. Умови реакції складали 15 хвилин при 95 ° C для активації HotStarTaq, потім 38 циклів по 30 секунд при 95 ° C, 30 секунд при 60 ° C і 30 секунд при 72 ° C, і 7 хвилин остаточного розтягування при 72 ° C У кожну партію ампліфікації були включені контрольні зразки, на яких була опущена ДНК. Успіх реакції ПЛР та відсутність перехресного забруднення в негативних контролях перевіряли за допомогою 1,5% електрофорезу в агарозному гелі. Очікуваний розмір продуктів ПЛР становив 174 п.н. для NQ01 та 107 п.н. для MnSOD .

Аналіз поліморфізму довжини фрагмента обмеження

Десять мікролітрів продукту ПЛР перетравлювали протягом ночі при температурі 37 ° C 5 одиницями HinfI (NQ01) або NgoM IV (MnSOD) (New England Biolabs Ltd., Hitchin, Великобританія) у загальному обсязі 20 мкл. Генотипи візуалізували за допомогою 3% (NQ01) або 4 (MnSOD) агарозного гелевого електрофорезу продукту ПЛР у 0,5-кратному трисборатному буфері етилендіамінтетраоцтової кислоти, що містить 0,5 мкг/мл броміду етидію (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, UK). Для поліморфізму NQ01 алель C візуалізували у вигляді смуги 174 bp, тоді як алель T розщеплювали на два фрагменти 122 і 52 bp (рис. 1). Алель Т поліморфізму MnSOD був ідентифікований необробленим продуктом 107 п.н., тоді як алель С утворив два фрагменти 89 та 18 п.н. (рис. 2). Після підтвердження правильного генотипу шляхом секвенування (GRI Genomics, Rayne, Великобританія), один зразок для кожного з трьох генотипів був включений до всіх партій ампліфікації та травлення в якості контролю якості. Генотипування повторювали для 10% зразків і показали незмінні результати у всіх випадках.

Генотипи NQ01 C609T візуалізуються за допомогою 3% електрофорезу в агарозному гелі. Алель С виглядає у вигляді смуги 174 bp, тоді як алель T позначений двома фрагментами 122 і 52 bp. A, контроль CC; В, контроль КТ; С, контроль ТТ; N, перевірити без таблички; M, сходи 100 bp. Цифри вгорі вказують на засвоєний продукт ПЛР для кожної людини.

Повнорозмірне зображення

Генотипи MnSOD виявлені 4% -ним електрофорезом в агарозному гелі. Алель Т візуалізується як неперетравлений фрагмент 107 п.н., тоді як алель С позначається двома фрагментами 89 та 18 п.н. A, контроль CC; Контроль В, ТТ; С, контроль КТ; Сходи M1 та M2, 100 bp; N, перевірити без шаблону. Цифри вгорі вказують на засвоєний продукт ПЛР для кожної людини.

Повнорозмірне зображення

Статистичний аналіз

Відмінності в категоріальних змінних (стать чоловіків/жінок, ніколи/ніколи не палять) між досліджуваними групами оцінювали за допомогою тесту Пірсона χ 2. Тест Крускала-Уолліса використовували для порівняння безперервних змінних (вік, ІМТ та споживання алкоголю), оскільки ці змінні не відповідали нормальному розподілу, як вказує тест Колмогорова-Смірнова. Співвідношення курсів (OR) та 95% довірчих інтервалів (CI), пов’язані з конкретними генотипами, були розраховані шляхом багаторазової логістичної регресії з урахуванням статі, віку, ІМТ, рефлюксу та статусу куріння та без нього. Статистичний аналіз проводили з використанням програмного забезпечення SPSS 12.0 (SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс) та STATA 7 (STATA Corporation, College Station, TX). Крім того, частоти генотипів перевіряли на рівновагу Харді-Вайнберга за допомогою тесту Good State 2 (Graphpad Instat, 2, 05). P 0,05), за винятком поліморфізму NQ01 у пацієнтів з езофагітом (P = 0,005). Істотних відмінностей у частоті генотипів поліморфізму MnSOD між групами не спостерігалось (Р = 0,289) (Таблиця 2). На відміну від них, частоти поліморфізму NQ01 C609T (P 0, 500) (Таблиця 3).

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

ОБГОВОРЕННЯ

Симптоми рефлюксу характерні для західних груп населення, 34, 35 років, але коли цих пацієнтів поміщають на ендоскопію, у деяких немає видимої патології, у деяких розвинувся езофагіт, а у інших - передракове ураження ВЕ, що пов'язано з підвищеним ризиком прогресування до EAC. Намагаючись покращити прогноз ЕАК шляхом ранньої діагностики, Американський коледж гастроентерології рекомендує включати всіх пацієнтів з ВЕЕ в ендоскопічні програми спостереження. 37 Однак розробка генетичних маркерів для ідентифікації підгрупи пацієнтів із ВЕ, які частіше переростають у рак, дозволить спеціально наглядати за особами з підвищеним ризиком. Отже, метою цього дослідження було оцінити, чи можуть генетичні поліморфізми в генах, пов’язані із захистом від вільних радикалів та детоксикацією ксенобіотиків, сприяти неоднорідності розвитку патології стравоходу та чи можна їх використовувати як показники більш високого ризику прогресування.

Результати нашого дослідження узгоджуються з результатами попередніх досліджень, які демонструють подібний захисний ефект алеля нульового Т проти поліморфізму Т раку легенів із зниженим ризиком раку легенів. Рак Res 1999; 59: 3045–3048. "Href =/articles/gim200757 # ref38 aria-label =" Reference 38 "data trace = click data trace = link> 38-41, ймовірно, через зменшення активізуючого впливу NQO1 на канцерогени 41 Однак інші дослідження свідчать про те, що зменшення NQ01 активність, пов’язана з алелем Т, може спричинити рак шлунка, товстої кишки, сечового міхура, шийки матки, 44 та молочної залози 45. Явна контрастна роль цього поліморфізму при різних злоякісних пухлинах може відображати складний вплив NQ01 на метаболізм канцерогену та його здатність виконувати як антиоксидантну, так і прооксидантну активність. Наприклад, деякі нітрозосполуки в продуктах харчування та деякі токсичні речовини, що містяться в дизельних екс-австралях, активуються NQ01

Щодо ролі NQ01 у канцерогенезі стравоходу, то в одному дослідженні генотип ТТ був пов’язаний із підвищеним ризиком плоскоклітинного раку. 31 Контраст між захисним ефектом високої активності NQ01 при плоскоклітинному раку стравоходу та нашими висновками про схильну роль до ЕАК може відображати різну етіологію цих двох гістологічно різних типів раку стравоходу. Наприклад, NQ01 може активувати специфічні канцерогени, які беруть участь виключно у розвитку ЕАК, такі як екзогенні та ендогенні сполуки, що містяться при зворотному звороті. Нітрозосполуки можуть бути прийнятною мішенню для цієї активації, враховуючи їх нову роль у розвитку BE та EAC. 12-14

На відміну від наших результатів, схильний вплив алеля NQ01 T на EAC вже був запропонований в невеликому дослідженні, що включало 61 випадок EAC, 30 хоча подальше велике дослідження з тієї ж групи не підтвердило цих попередніх результатів. 47 Відсутність асоціації у дослідженні фон Радена та його колег 47 може бути зумовлена ​​тим фактом, що під час їх розслідування випадки EAC порівнювали із здоровими добровольцями без рефлюксу. Як зазначалося вище, захисний ефект генотипу ТТ можна побачити лише у присутності прокарциногену, що міститься в рефлюксі. Однак, через ці розбіжності, роль поліморфізму NQ01 у канцерогенезі стравоходу повинна з'ясувати в подальших дослідженнях. Зокрема, було б цікаво підтвердити, чи впливає цей поліморфізм на ймовірність прогресування ВЕ та ЕАК у контексті великого проспективного дослідження, що включає пацієнтів із симптомами хронічного рефлюксу.

У нашому дослідженні ми також дослідили поліморфізм гена, що кодує поглинач вільних радикалів MnSOD. Цей фермент відіграє вирішальну роль у захисті від вільних радикалів, каталізуючи видалення супероксидних радикалів до перекису водню, який потім перетворюється у воду за допомогою каталаз та пероксидаз. Недавня доповідь показала, що рівні MnSOD в стравоході змінюються під час розвитку ЕАК, 48 що підтверджує можливу важливу захисну роль цього ферменту проти канцерогенезу стравоходу. Розглянутий тут поліморфізм від С до Т призводить до заміщення аланіну в положенні 14 білка MnSOD валіном, змінюючи тим самим ефективність транспорту зрілого білка до правильної субклітинної локалізації. 21, 22 Як результат, показано, що цей поліморфізм модулює схильність до ряду злоякісних захворювань, включаючи рак молочної залози, 23, 24 яєчників, 25 сечового міхура, 26 та легенів 27. Хоча експерименти на тваринах показали, що введення СОД може зменшити опосередковану рефлюксом пошкодження стравоходу, 6, 7, наші результати свідчать про те, що генотип на сайті MnSOD C14T не робить істотного впливу на ризик ускладнень, пов'язаних з рефлюксом, таких як BE або EAC. невеликий ефект, який можна було побачити в більш масштабних дослідженнях.

Езофагіт та ВЕ є загальними виявленнями у пацієнтів із симптомами рефлюксу та рекомендуються для ендоскопії (37% та 23% відповідно). Оскільки і пацієнти, і контролі у цьому дослідженні потрапляли до диспепсії та ендоскопічної клініки Баррета, головна сила нашого дослідження полягає в тому, що всі пацієнти проходили ендоскопічне обстеження, щоб дозволити включення у відповідну дослідну групу. У результаті, однак, наше дослідження обмежене відносно невеликою кількістю прийнятих пацієнтів, а це означає, що роль цього поліморфізму в канцерогенезі стравоходу потребує подальшого з'ясування в контексті більш масштабного дослідження. Крім того, хоча наші результати свідчать про те, що генотип NQO1 TT може захищати від прогресування до EAC, його розвиток як генетичного маркера для виявлення пацієнтів із меншим ризиком прогресування здається неможливим через низьку частоту цього генотипу у осіб, які не хворіють на захворювання (7,6 % -5,4%).

На закінчення, наші результати свідчать про те, що поліморфізми NQ01 C609T можуть відігравати певну роль у сприйнятливості пацієнтів з ГЕРХ до рефлюкс-ускладнень і що у пацієнтів з аллелями Т може бути менший ризик прогресування до BE та EAC. Потрібні більші дослідження для підтвердження цих висновків та дослідження взаємодії між цим генетичним поліморфізмом та конкретними експозиціями або з поліморфізмами у споріднених генах.