популяції

  • Предмети
  • Резюме
  • Передумови:
  • Методи:
  • Результати:
  • Завершення:
  • Довіритель
  • Результати
  • Розмір популяції клітин NK
  • Експресія мРНК Intelectin-2 в NK-клітинах, виділених з PBMC
  • Цитотоксичність NK-клітин
  • Експресія гена NK-клітин, пов'язана з NK-клітинами, виділеними з PBMC
  • Обговорення
  • Методи
  • Хімічні продукти
  • bLf
  • Дієтичні процедури та протокол для тварин
  • Збір зразків
  • Ізоляція PBMC
  • Повна ізоляція клітин селезінки та MLN
  • Виділення NK-клітин та фенотипічна ідентифікація щодо чистоти
  • Аналіз цитотоксичності NK-клітин методом проточної цитометрії
  • Фенотипова ідентифікація мононуклеарних клітин крові та загальних клітин MLN та селезінки
  • Експресія гена NK-клітини
  • Статистичний аналіз
  • Звіт про фінансову підтримку
  • Одкровення
  • Додаткова інформація
  • Файли Powerpoint
  • Додатковий малюнок S1.

Предмети

  • NK-клітини
  • Харчування
  • Педіатрія

Резюме

Передумови:

Клітини природних кілерів (NK) є компонентами вродженої системи імунного захисту, і їх рівень відрізняється між немовлятами та немовлятами на штучному вигодовуванні (FF). Лактоферрин (Lf) модулює цитотоксичність NK-клітин ex vivo. Ми припустили, що дієта Lf (bLf) великої рогатої худоби збільшить популяції NK-клітин та цитотоксичність.

Методи:

Поросят вирощували свиноматками (SR), FF або 1 г/л, що годували bLf (LF) протягом 21 доби. NK-клітини (CD3 - CD4 - CD8 +) у крові (одноядерні клітини периферичної крові (PBMC)), селезінці та мезентеріальних лімфатичних вузлах (MLN) визначали за допомогою проточної цитометрії. NK-клітини PBMC тестували на цитотоксичну активність щодо клітин-мішеней K562 ex vivo у присутності середовища (не стимульованого), інтерлейкіну-2 або bLf. Експресію мРНК NK-клітин визначали за допомогою кількісної ПЛР зворотної транскрипції.

Результати:

У поросят SR та LF було більше NK-клітин у MLN (P = 0,0097) та селезінці (P = 0,0980), ніж у поросят FF. У PBMC у поросят SR було більше NK-клітин, ніж у поросят FF (P = 0,0072); Поросята LF були проміжними і не відрізнялися від поросят FF або SR. Експресія мРНК інтелекту-2 NK-клітин була в 2,5 рази вищою (Р = 0,0095) у LF, ніж у поросят SR або FF. NK-клітини у поросят SR виявляли вищу цитотоксичну активність (P

Ряд мРНК Intelectin-2 був вищим у природних клітинах-кілерах поросят, яких годували 21-денним bLf (LF, n = 3), ніж у поголів’я свиноматок (SR, n = 7) або годували сумішшю (FF, n = 6) тварини. Нормалізовані значення для інтелектину-2 розраховували шляхом ділення середньої цільової кількості на середню кількість еталонного гена (пептидилпроліл ізомерази А). Різницю в кратності розраховували для кожного вимірювання шляхом ділення нормованих цільових значень на середнє нормоване цільове значення для свиней FF. Дані виражаються як середнє значення ± SD різниці складок щодо тварин FF. * P ≤ 0,05. bLf, бичачий лактоферин.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Цитотоксичність NK-клітин

NK-клітини, виділені з PBMC від SR-тварин, нестимульовані або стимульовані інтерлейкіном-2 (IL-2) або bLf, виявляли вищу цитотоксичну активність (P

Цитотоксичність клітин природних кілерів (NK), виділених від свиноматок, вирощених 21 день (SR; n = 11; чорний), годували сумішшю (FF; n = 14; білі) та годували bLf (LF; n = 11 сірих поросят). Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) NK-клітини або нестимулювали (Unst), або стимулювали інтерлейкіном-2 (IL-2) (20 нг/мл) або Lf (25 мкг/мл) і інкубували протягом 48 годин з DiOC 18 з міткою K562 клітини-мішені з ефектом 10: 1. Співвідношення клітин-мішеней. Йодид пропідію (ПІ) додавали в кінці інкубації для мічення мертвих клітин. Цитотоксичність повідомляється як знищені клітини-мішені (PI + DiOC 18 +) у відсотках від загальної кількості клітин-мішеней (DiOC 18 +). Дані виражаються як середнє значення ± SD. Повна модель узагальненої лінійної моделі (GLM), P † вказує на значні відмінності між дієтами. bLf, бичачий лактоферин.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Експресія гена NK-клітин, пов'язана з NK-клітинами, виділеними з PBMC

Намагаючись визначити можливі молекулярні механізми, які могли б сприяти зниженню цитотоксичної активності NK-клітин тварин FF та LF, була проведена кількісна ПЛР зворотної транскрипції РНК, витягнутої з клітин CD3 - CD4 - CD8. + NK з нестимульованої периферичної крові ( Малюнок 3 ) Рівень мРНК перфорину, ефекторної молекули для NK-клітин, був у три та шість разів нижчим у NK-клітинах у поросят FF та LF, ніж у поросят SR (P = 0,0038, Малюнок 3а ). Крім того, експресія D-рецептора NK-члена групи 2 (NKG2D), активуючого рецептора, виявленого на NK-клітинах і відомого як K-підсімейний рецептор 1 лектиноподібного рецептора клітин-кілерів, була в 3,5 рази нижчою в NK-клітини тварин FF, ніж у тварин SR, тоді як експресія гена рецептора NKG2D у NK-клітинах тварин LF була проміжною і не суттєво відрізнялася від будь-якої з груп ( Малюнок 3b ).

Перфорин ( до ) і рецептор D (NKG2D) групи 2 групи NK ( b ) Ряд мРНК у природних клітинах-кілерах, виділених від свиноматок, вирощених на 21 день (SR, n = 7), годували сумішшю (FF, n = 4-5) та поросят, які годували bLf (LF, n = 3) Нормалізовані значення для цільових генів розраховували шляхом ділення бажаної середньої кількості на середню кількість еталонного гена. Різницю в кратності розраховували для кожного вимірювання шляхом ділення нормованих цільових значень на середнє нормоване цільове значення для свиней FF. Дані виражаються як середнє значення ± SD. Різні індекси (*, †, ‡) вказують на суттєві відмінності при P ≤ 0,05. bLf, бичачий лактоферин.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Обговорення

Загалом, дієта мала значний вплив на популяцію та активність NK-клітин. Поросята, яких годували грудним молоком, мали більший розмір популяції NK-клітин у крові та імунних тканинах та вищу цитотоксичну активність (PBMC) порівняно з поросятами, які були FF. Однак загальний вплив bLf на розвиток NK-клітин у цьому дослідженні не було остаточним. Харчові добавки bLf не підвищували цитотоксичність NK-клітин; проте той факт, що поросята LF мають більшу кількість NK-клітин периферичної крові з вищою експресією LfR, може потенційно покращити імунний захист новонародженого. Крім того, добавки протягом більш ніж 21 дня або більше доз bLf можуть бути більш ефективними для посилення вродженої імунної відповіді у цих тварин, оскільки доза, використана в цьому дослідженні (1 г/л), знаходиться на нижньому кінці наявного. грудне молоко людини (

2,1 г/л). Тому необхідні майбутні дослідження, щоб визначити, чи залежить імунна регуляторна роль bLf в активності NK-клітин від певного комплексу умов, тобто патогенного ураження, віку чи виду. Оскільки клітини NK є важливою першою лінією захисту від інфекції, розуміння факторів, що збільшують їх кількість та підвищують здатність до вбивства, може краще захистити немовлят із FF від інфекції за допомогою дієти.

Методи

Хімічні продукти

Всі хімічні речовини були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі), якщо не зазначено інше.

Порошковий bLf (чистота 98%) був отриманий від DMV International (FrieslandCampina, Нідерланди). Загальний вміст заліза становив 120 мг/кг порошку, що представляло б 11,9% насичення, якби все залізо було зв’язане ЬФЛ. BLf відновлювали у подвійно дистильованій деіонізованій воді в концентрації 100 г/л. Під час приготування формули 10 мл цього розчину додавали до 1 л формули для кінцевої концентрації 1 г/л bLf.

Дієтичні процедури та протокол для тварин

Збір зразків

На післяпологовий 21 день поросятам вводили внутрішньом’язову ін’єкцію телазолу (7 мг/кг мас. Т .; Форт Додж Здоров’я тварин, Форт Додж, ІА), а кров збирали внутрішньосерцевою пункцією у вакуумних пробірках, що містять гепарин (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія). ) для ізоляції PBMC. Поросят евтаназували внутрішньосерцевою ін’єкцією пентобарбіталу натрію (72 мг/кг т. Д., Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). Після евтаназії відбирали зразки селезінки та MLN для повної ізоляції клітин.

Ізоляція PBMC

Кров розбавляли 2: 1 RPMI-1640 (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), шарували у Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) і центрифугували при 400 g протягом 40 хв при 20 ° C. зібрані з градієнтного інтерфейсу. Еритроцити лізували за допомогою буфера для лізису (0,15 моль/л NH 4 Cl, 10 ммоль/л KHCO 3 та 0,1 ммоль/л Na 2 EDTA). PBMC промивали три рази в промивному буфері, складеному забуференним сольовим розчином Ханка (без Ca 2+, без Mg 2+ (HBSS; Invitrogen, Gibco), доповненого 2% BSA, 1 ммоль/л Na 2 EDTA, 50 мкг/мл гентаміцину (Invitrogen, Gibco), пеніциліну 1000 ОД/мл та стрептоміцину 100 мкг/мл). PBMC суспендували в повному обсязі RPMI-1640 (10% FBS, 2 ммоль/л глутаміну, 50 мкг/мл гентаміцину, 1 ммоль/л пірувату натрію, 20 ммоль/л HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 од/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину). Кількість життєздатних клітин оцінювали підрахунком після фарбування трипановим синім (Invitrogen, Gibco). Клітини фенотипували і кількісно визначали за допомогою проточної цитометрії або використовували для виділення NK-клітин, як описано нижче.

Повна ізоляція клітин селезінки та MLN

Зразки селезінки та MLN збирали та зберігали на льоду в збірному буфері, що містить антибіотики, до обробки. Тканини промивали три рази (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 мкг/мл гентаміцину, 1000 од/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину). Вимиті тканини поміщали в С-пробірки (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) з 10 мл забуференного фізіологічного розчину Хенка і вирізали за допомогою щадного MACS (Miltenyi Biotec). Отримані розчини клітин фільтрували через 100 мкм клітинний фільтр (BD Falcon, Сан-Хосе, Каліфорнія), а потім 40 мкм клітинний фільтр (BD Falcon). Після лізису еритроцитів, виділені клітини тричі промивали в промивному буфері і суспендували в повному обсязі RPMI-1640. Кількість життєздатних клітин оцінювали підрахунком після фарбування трипановим синім (Invitrogen, Gibco). Потім клітини фенотипували за допомогою проточної цитометрії, як описано нижче.

Виділення NK-клітин та фенотипічна ідентифікація щодо чистоти

Аналіз цитотоксичності NK-клітин методом проточної цитометрії

Фенотипова ідентифікація мононуклеарних клітин крові та загальних клітин MLN та селезінки

Експресія гена NK-клітини

Загальну РНК екстрагували та очищали з NK-клітин, виділених з PBMC, реагентом TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY) згідно з протоколом виробника. РНК визначали за допомогою спектрофотометрії з використанням Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Рокфорд, Іллінойс) при 260 нм. Загалом для екстракції та виробництва було використано 10 мільйонів NK-клітин

800-1000 нг/мкл РНК. Концентрацію РНК відрегулювали до 0,25 мкг/мл, використовуючи воду без РНКази (Invitrogen), а якість РНК аналізували за допомогою біоаналізатора (модель 2100; Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія) в Університетському центрі Кема в Іллінойсі. Усі зразки мали номер цілісності РНК> 6.

Зворотну транскрипцію проводили, використовуючи термоциклер Eppendorf (Fisher Scientific, Пітсбург, Пенсільванія). Кожна реакція містила 3 ​​мкг загальної РНК і 10 мкл суміші для зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) із залученням 100 ммоль/л дезоксирибонуклеотидтрифосфату (dNTP), 10X RT буфер, 10X RT випадкові праймери, MultiScribe Reverse Транскриптаза, інгібітор РНКази та вода діетилпірокарбонату (DEPC) (Invitrogen) в кінцевому об’ємі 20 мкл.

Кількісну ПЛР у реальному часі проводили для ITLN-2 (Ss03374218_m1), KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) та перфорину (Ss03373694_m1), а також пептидилпроліл ізомерази A (Ss03392377_m1), використовуючи аналіз Taqman. Зразки подавали в цілому 40 циклів ампліфікації за пробіг, і інтенсивність флуоресценції визначали за допомогою машини Taqman ABI 7900 (Applied Biosystems). В якості еталонного гена використовували пептидилпролілізомеразу А (31). Результати виражали методом відносної стандартної кривої. Коротко кажучи, проводили послідовне розведення (від 1: 5 до 1:15, 625) із запасу злитої кДНК NK-клітин свині та проводили на кожній пластині. Кожну пробу запускали в трьох примірниках з праймерами для оцінки цільового гена та пептидилпроліл-ізомерази А. Нормалізовані значення для кожної мішені розраховували шляхом ділення середнього значення цільової кількості на середнє значення пептидпропроліл-ізомерази А. Різницю в кратному обчисленні обчислювали для кожного вимірювання шляхом ділення нормованих цільових значень на нормований зразок калібратора (у цьому випадку середнє значення для групи FF). Всі зразки, які тестували на статистичні відмінності, проводили на одній тарілці.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою узагальненої лінійної моделі Proc у межах SAS (Версія 9.2; Інститут SAS, Кері, Північна Кароліна). Модель аналізу популяції клітин NK та експресії генів містила дієту як головний ефект. Модель цитотоксичності NK-клітин містила вплив дієти, лікування та взаємодії дієти × лікування. Нормальний розподіл даних був підтверджений тестом на нормальність в межах SAS, а число Шапіро - Вілка ≥0,75 вказувало на те, що значення розподілялися в нормі. Дані подаються як середнє значення ± SD. Порівняння з Р