реферат

Головний

Для лікування гломерулонефриту терміни та тривалість прийому препарату повинні базуватися на точній оцінці місцевого мікроскопічного запалення. Хоча для цього часто використовують серологічні та сечові маркери, ці параметри безпосередньо не відображають запальну активність. Білки гострої фази, включаючи С-реактивний білок, не є корисними маркерами для моніторингу запалення клубочків. Сучасним, найбільш надійним методом оцінки гломерулонефриту є гістопатологічний аналіз з використанням біопсії нирок. Однак біопсія тканини є інвазивною з ризиком ускладнень, таких як масивна кровотеча. Крім того, це не дозволяє проводити пост-оцінку, яка часто необхідна при нестабільному, коливальному гломерулонефриті. Наразі технології постійної неінвазивної оцінки запалення клубочків відсутні. У цьому звіті ми зосередилися на створенні генетичного біосенсора in vivo, придатного для цієї мети.

Раніше ми вже описували підхід передачі генів ex vivo, який конкретно націлений на клубочки. 1 Цей метод використовує клубочкову мезангіальну клітину як вектор для доставки генів. Тобто, мезангіальні клітини культивували з ізольованих клубочків, стабільно трансфікували чужорідними генами in vitro і передавали назад до клубочків через нирковий кровообіг. Введені клітини розподілялись по введеній нирці та вибірково накопичувались у клубочках. Стійке виживання клітин та експресія трансгену зберігаються щонайменше кілька тижнів. Ми використали цей підхід клітинної передачі, щоб створити місцевий біосенсор, який сприймає і повідомляє про клубочкову запальну активність.

Як згадувалося вище, SRE може служити молекулярним датчиком гломерулонефриту. Однак активність промотору SRE щодо стимулювання експресії чужорідних генів є відносно слабкою в клітинах мезангіальних клітин. Тому в цьому звіті ми використовували альтернативний елемент запальної реакції, підсилювач KB, як сенсор для гломерулонефриту. Ядерний фактор -KB (NF-kB) - це всюдисущий, плейотропний фактор транскрипції, який бере участь у різних запальних процесах. 9, 10 Під час експериментального та людського гломерулонефриту активується NF-κB, 11, 12, 13, що призводить до експресії генів, асоційованих із запаленням у клітинах клубочка. 14, 15 Елемент підсилювача KB повинен бути корисним як датчик для гломерулонефриту.

У цьому звіті ми наводимо експериментальні докази того, що місцеве запалення можна контролювати неінвазивно за допомогою біосенсора, який генерується локально. Використовуючи гломерулонефрит як модель захворювання, ми демонструємо можливість використання системи зондування K B-SEAP для постійного моніторингу in vivo місцевого мікроскопічного запалення.

Матеріали і методи

Клітини та реактиви

Мезангіальні клітини (SM43), утворені з ізольованих чоловічих клубочків щурів Sprague-Dawley 1, підтримували в середовищі, що містить 5% фетальної бичачої сироватки (FBS). Як правило, для досліджень використовували середовище, що містить 1% FBS. Моногідрат циклофосфаміду був придбаний у Wako (Осака, Японія). Людський рекомбінантний IL-1β і TNF-α були щедрими пожертвами від Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd (Токусіма, Японія) та Dr. Кацуо Ногучі (Медична школа Університету Тейкьо, Токіо, Японія).

Стабільна трансфекція

Датчик мезангіальних клітин SM/NF-kB B-SEAP5 визначали шляхом котрансфекції клітин SM43 за допомогою pNF-kB B-SEAP (BD Biosciences, Пало-Альто, Каліфорнія, США) та pcDNA3.1. (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США), як описано вище. 16 pNF-kB B-SEAP кодує SEAP під контролем чотирьох копій елемента підсилювача kB. Трансфекції клітин мезангіального типу, що експресують поодинці нео, визначали шляхом трансфекції pcDNA3.1. Фенотип клітин мезангіальних клітин підтверджено позитивним фарбуванням актину α-гладкої мускулатури та Thy 1, 1 з використанням моноклональних антитіл проти α-гладких м’язів актину (розведення 1: 300; Sigma, St Louis, MO, USA) та анти -Ти 1,1 моноклональні антитіла 1-22-3 (5 мкг/мл), 17 відповідно.

Аналіз північного плями

Загальну РНК екстрагували одноетапним методом, 18 і проводили аналіз Норт-блот, як описано вище. 19 Як зонд SEAP, 1,5 кб Hind III-XbaI-фрагмент від pSEAP2-контролю (BD Biosciences) був радіомаркований і використаний для гібридизації. Як контроль завантаження використовували експресію гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази.

Тест SEAP

Активність SEAP оцінювали методом хемілюмінесценції з використанням набору виявлення Great EscAPe SEAP (BD Biosciences). Коротко кажучи, 5 мкл культурального середовища або сироватки щурів змішували з 15 мкл 1x буфера для розведення та інкубували при 65 ° C протягом 30 хвилин. Після інкубації зразки змішували з 20 мкл аналітичного буфера, що містить L-гомоаргінін, залишали на 5 хвилин при кімнатній температурі, а потім додавали 20 мкл хемілюмінесцентного підсилювача, що містить 1,25 мМ хемілюмінесцентного субстрату CSPD. Після інкубації в темряві протягом 30 хвилин зразки вимірювали на активність SEAP за допомогою люмінометра (Gene Light 55; Microtech Nition, Funabashi, Chiba, Японія).

Перехресне дослідження

Кондиціоновані середовища готували з ізольованих нормальних та нефритичних клубочків щурів. Для одержання останнього гломерулонефриту проти Thy 1 у дорослих самців щурів Sprague-Dawley, як описано вище, індукували моноклональні антитіла 1-22-3 17. Через 4 дні після ін'єкції антитіл гломерули виділили та 1 х 10 4 клубочки інкубували протягом 24 годин в 1 мл живильного середовища, що містить 1% FBS. Кондиціоновані середовища збирали, центрифугували для видалення нерозчинних речовин і використовували для кросинговельних досліджень. Коротко, сенсорні клітини піддавали дії розведеного 1: 1 (50%) кондиціонованого середовища протягом 24 годин, і культуральне середовище збирали для аналізу SEAP.

Ex Vivo Sensing гломерулонефрит

Сенсорні клітини (1 х 106) трипсинізували та вводили в ліву ниркову артерію нормальних щурів або нефритичних щурів, що зазнали впливу гломерулонефриту проти Thy 1 (день 1), як описано вище. 1, 4, 21 Після ін’єкції клітин, клубочки були виділені з обох нирок за допомогою звичайного методу просіювання. Всі 1000 клубочків інкубували в 100 мкл середовища, що містить 1% FBS, і через 12 годин середовище збирали для аналізу SEAP. Щоб дослідити можливий прямий вплив антитіла проти Thy 1 на секрецію SEAP в сенсорних клітинах, клітини обробляли 1-22-3 (0,5 - 5 мкг/мл) протягом 24 годин і оцінювали активність SEAP.

Оцінка ефективності передачі клітин

Ефективність перенесення сенсорних клітин у клубочки оцінювали, як описано вище. Коротко, трипсинізовані клітини (1 х 106) фарбували флуоресцентним барвником 1,1'-діоктадецил 3,3,3 ', 3'-тетраметиліндокарбоціанін перхлорат (DiI; Molecular Probes, Eugene, OR, USA; 4 мкг/мл ) при 37 ° С протягом 30 хвилин і вводили в ліву ниркову артерію щурів. Після відновлення ниркового кровообігу обидві нирки видаляли і використовували для приготування ізольованих клубочків. Ізольовані клубочки піддавали флуоресцентній мікроскопії для оцінки відсотка DiI-позитивних клубочків.

Моніторинг in vivo гломерулонефриту

Щурів поділяли на чотири групи: нормальних щурів, нормальних щурів, яким вводили сенсорні клітини, нефритичних щурів та нефритичних щурів, яким вводили сенсорні клітини. У групах, яким вводили сенсорні клітини, 1 х 10 6 клітин SM/NF-kB B-SEAP5 вводили в ліву ниркову артерію нормальних щурів або нефритичних щурів, що зазнали дії гломерулонефриту проти Thy 1 (день 1). Сироватки збирали до та через 1, 3, 6, 8 та 10 днів після ін'єкції клітин та піддавали аналізу SEAP. Щоб перевірити, чи сприймають сенсорні клітини та реєструють лише місцеве запалення там, де розташовані сенсорні клітини, 1 х 10 6 сенсорних клітин вводили внутрішньочеревно внутрішньочеревно нефритичним щурам і досліджували рівень SEAP у сироватці крові протягом 9 днів. Кожна експериментальна група включала щонайменше чотирьох щурів.

Для підтвердження того, що введені сенсорні клітини вижили в клубочках під час дослідження, клубочки були виділені з обох нирок наприкінці кожного експерименту (день 10) та культивовані у присутності 10% FBS. Зростаючі клітини відбирали при 330 мкг/мл G418, фіксували 1% формальдегідом і фарбували гематоксиліном для візуалізації стійких до неоміцину клітин.

У щурів внутрішньочеревна ін’єкція імунодепресивного циклофосфаміду спричинює> 98% виснаження циркулюючих лейкоцитів протягом 2 днів, що призводить до придушення запалення клубочків та протеїнурії при експериментальному гломерулонефриті. Щоб визначити, чи призводить терапевтичне втручання при гломерулонефриті до зменшення рівня SEAP у сироватці крові, щурам вводили внутрішньочеревно циклофосфамід (165 мг/кг маси тіла) за 2 дні до ін’єкції сенсорних клітин. Через 3 дні (1-й гломерулонефрит, 2-й день) сироватки збирали у оброблених циклофосфамідом (+) та необроблених (-) нефритичних щурів та піддавали тесту SEAP.

Дослідження імунофлуоресценції

Готували заморожені зрізи товщиною 8 мкм та інкубували з анти-щурячим моноклональним антитілом ED1 (розведення 1: 200; Chemicon International Inc., Темекула, Каліфорнія, США) протягом 60 хвилин. Після промивання зрізи інкубували з кон’югованими Alexa Fluor 488 антимишачими імуноглобулінами (розведення 1: 1500; молекулярні зонди) протягом 60 хвилин і піддавали флуоресцентній мікроскопії. Підраховували кількість ED1-позитивних клітин на повнорозмірний клубочок і використовували середні значення для порівняння в різних групах.

Статистичний аналіз

Дані були виражені як середнє значення ± se. Статистичний аналіз проводили за допомогою непараметричного U-критерію Манна-Уітні. P

моніторинг

Сенсорні клітинні зондування прозапальних цитокінів. Клітини марганцю щурів стабільно трансфікували секретованою геном лужної фосфатази (SEAP) під контролем елементів, що підсилюють KB, і генерували чутливий до запалення клон SM/NF-kB B-SEAP5. a ) Імунофлуоресцентне фарбування для мезангіальних клітинних маркерів, α-актину гладкої мускулатури та Thy 1.1. NC, негативний контроль. ( b ) Норт-блот-аналіз експресії SEAP у сенсорних клітинах, що піддаються дії цитокінів. Клітини піддавали впливу IL-1β (10 нг/мл) або TNF-α (250 Од/мл) протягом 24 годин і оцінювали експресію мРНК SEAP. Експресія гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPHD) показана як контроль навантаження. ( c ) SEAP секреція сенсорними клітинами, що піддаються дії цитокінів. Клітини обробляли IL-1β або TNF-α протягом 24 годин, а активність SEAP у культуральному середовищі оцінювали за допомогою аналізу хемілюмінесценції. Випробування проводили в чотирьох екземплярах. Дані представлені як середнє значення ± se, а зірочки вказують на статистично значущі відмінності (P

Відчуття запалення клубочків in vitro за допомогою сенсорних клітин: перехресне дослідження. Сенсорні клітини протягом 24 годин виставляли в розведеному (50%) середовищі, розведеному 1: 1, кондиціонованому ізольованими нормальними або нефритичними клубочками, підданими дії гломерулонефриту проти Thy 1 (день 4). Культуральні середовища збирали та піддавали аналізу SEAP. Випробування проводили в чотирьох екземплярах. Дані представлені як середнє значення ± одна зірочка вказує на статистично значущу різницю від безумовного середовища (контроль), а подвійна зірочка вказує на статистично значущу різницю від "нормального" кондиціонованого середовища.

Повнорозмірне зображення

Поступова оцінка гломерулонефриту in vivo. Сенсорні клітини (1 x 10 6 клітин) вводили в ліву ниркову артерію нормальних щурів або нефритичних щурів, які перенесли гломерулонефрит проти Thy 1 (1 день). Щурів поділяли на чотири групи: нормальних щурів (група A, n = 5), нормальних щурів, яким вводили сенсорні клітини (група B; n = 4), нефритичних щурів (група C; n = 4) та нефритичних щурів, яким вводили розчин для ін'єкція. сенсорні комірки (група D; n = 5). До і після ін’єкції клітин сироватки збирали кожні 2-3 дні та піддавали тесту SEAP. Щоб визначити, чи сприймають сенсорні клітини лише місцеве запалення, де розташовані клітини, 1 × 10 6 сенсорних клітин (група E; n = 4) вводили внутрішньочеревно внутрішньочеревно та контролювали рівень SEAP у сироватці крові. до 9 днів. Дані представлені як середнє значення ± se, а зірочки вказують на статистично значущі відмінності (P

Отримання сенсорних клітин з ізольованих клубочків. В кінці експериментів (день 10) клубочки були виділені з обох нирок нестероїдних щурів, переданих сенсорними клітинами, і культивовані у присутності 10% FBS. Нефритичні (-), нефритні клубочки без сенсорних клітин; нефритні (+), нефритні клубочки, що передаються сенсорними клітинами. Клубочки, виділені від неін'єкційних нормальних щурів (нормальні (-)), використовували як негативний контроль. Зростаючі клітини відбирали G418 (330 мкг/мл) протягом 1-2 тижнів, фіксували 1% формальдегідом і фарбували гематоксиліном для візуалізації стійких до неоміцину сенсорних клітин.

Повнорозмірне зображення

Щоб визначити, чи рівень SEAP у сироватці крові, що передається сенсорними клітинами, є нефритними щурами, зниженими терапевтичним втручанням, ми використовували протизапальний препарат циклофосфамід. У щурів внутрішньочеревна ін’єкція циклофосфаміду (165 мг/кг маси тіла) спричиняє значне придушення запалення клубочків та протеїнурії при експериментальному гломерулонефриті. 20 щурів отримали внутрішньочеревну ін’єкцію циклофосфаміду за 2 дні до ін’єкції сенсорних клітин. Через 3 дні (гломерулонефрит Thy 1, день 2) сироватки відбирали у нефритичних щурів, які отримували лікування та лікування нефритичних щурів, і піддавали тесту SEAP. Як показано на малюнку 7, введення циклофосфаміду суттєво послабило збільшення сироваткового SEAP у клітинних нефритичних щурів (кратне збільшення сироваткового SEAP: 1,81 ± 0,50 раза у щурів, оброблених циклофосфамідом, проти 3,46 ± 0,44-кратного для необроблених циклофосфамідів ). щури, P

У цьому дослідженні елемент підсилювача KB був використаний як датчик для запалення клубочків. Однак інші послідовності датчиків у поєднанні з репортерською системою SEAP можуть бути корисними для моніторингу гломерулонефриту in vivo. Можливими кандидатами для чутливих до запалення послідовностей є SRE та 12-о-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетатний елемент відповіді (TRE). Ми трансфікували мезангіальні клітини експресійними плазмідами, які вводять ген SEAP під контролем SRE або TRE. Стійкі клони були ідентифіковані та протестовані на індукцію SEAP у відповідь на подразники, включаючи сироватку, похідний із тромбоцитів фактор росту, ефір форболу та IL-1β. Індукція SEAP була неочікувано низькою для обох типів сенсорних клонів. На відміну від сенсорних клітин на основі KB, які досягали високих рівнів індукції SEAP до 70-80 разів, максимальні показники індукції були лише від двох до трьох разів (наші неопубліковані дані). Низька індукція SEAP у сенсорних клітинах на основі SRE та TRE може бути зумовлена ​​відносно високим рівнем базальної активності цих регуляторних елементів та/або низькою індуктивністю у відповідь на подразники в культивованих клітинах мезангіальних клітин.

Ми використовували SEAP як молекулу-репортер для визначення запалення клубочків. Наскільки нам відомо, це перша демонстрація корисності системи звітів SEAP для оцінки місцевого запалення in vivo. Активність SEAP у сироватці крові можна виміряти легко, швидко та чутливо, використовуючи звичайні хемілюмінесцентні методи. Це є великою перевагою репортерської системи SEAP. Одним з недоліків системи звіту про SEAP in vivo є те, що SEAP не виділяється з сечею. 8 і оцінка активності на основі сечі неможлива. Це пов’язано з тим, що молекулярна маса SEAP становить приблизно 64 кДа, 5, що є занадто великим для фільтрування через базальну мембрану клубочка. Інші менші молекули-репортери, такі як хоріонічний гонадотропін людини, можуть бути використані для моніторингу місцевої активності сечових захворювань 27, але будуть потрібні подальші дослідження.

Дякую

Ця робота була підтримана грантом на наукові дослідження Міністерства освіти, культури, спорту, науки та технологій, Японія (16390243 до MK).