слизової

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • Пацієнти та методи
  • Біологічна проба
  • Діагностичні критерії для CD та ITB
  • Підготовка зразка для маркування iTRAQ та сильної катіонообмінної хроматографії
  • Ідентифікація та кількісна оцінка білків
  • Біоінформатичний аналіз
  • імуногістохімія
  • результат
  • Протеомічні експерименти
  • Диференціальна експресія білка в макроскопічно ураженій слизовій оболонці товстої кишки пацієнтів з ІТБ порівняно з контрольними біопсіями
  • Диференціальна експресія білка в макроскопічно ураженій слизовій оболонці товстої кишки хворих на ЦД порівняно з контрольними біопсіями товстої кишки.
  • Диференціальна експресія білка в макроскопічно ураженій слизовій оболонці товстої кишки пацієнтів з CD та ITB
  • Біоінформатичний аналіз
  • Валідація диференційовано експресованих білків за допомогою імуногістохімії
  • обговорення
  • Детальніше
  • Коментарі

предметів

  • Хвороба Крона
  • Виразковий коліт

реферат

З огляду на останні події в клінічній протеоміці, ми використали цю методику для ідентифікації біологічних маркерів, що дозволяють відрізнити ІТБ від CD. Протеоміка є перспективною технологією і використовується для розуміння біологічних процесів, спричинених запальним захворюванням кишечника (ВЗК) 15. Оскільки і ITB, і CD першими з’являються на слизовій оболонці кишечника, порівняння протеома слизової обох захворювань може допомогти виявити диференційовано експресовані білки, їх потенційні мережі та взаємодії, пов’язані з розвитком двох захворювань. Протеомічний підхід вже застосовувався для виявлення відмінностей між різними формами колоїдів та для дослідження біомаркера активності захворювання 16, 17, 18, 19, 20. Протеоміка також використовується в галузі досліджень туберкульозу при пошуку біомаркерів 21. Ця технологія ще не досліджена для виявлення потенційно корисних маркерів, які можуть допомогти відрізнити ITB від CD.

У цьому дослідженні ми проаналізували та порівняли протеом запальної слизової оболонки пацієнтів з ІТБ та КР. Для порівняння протеомів двох умов для виявлення потенційних біомаркерів для диференціації двох захворювань була використана технологія ізобаричного маркування для відносного та абсолютного кількісного визначення (iTRAQ) з подальшою двовимірною рідинною хроматографією та тандемною мас-спектрометрією.

Пацієнти та методи

Пацієнтів з CD та ITB приймали з Індійського інституту медичних наук, клініка гастроентерології Нью-Делі. Це дослідження було схвалено Комітетом з етики нашої установи. Дослідження проводилось відповідно до рекомендацій Індійської ради з медичних досліджень/належної клінічної практики. Інформована та письмова згода була отримана від кожного учасника цього дослідження.

Була проведена повна оцінка пацієнтів, включаючи їх клінічні, ендоскопічні, рентгенологічні та гістологічні характеристики. Деталі прийому лікування туберкульозу в минулому були задокументовані. Після підготовки товстої кишки (поліетиленгліколь) всі пацієнти проходили колоноскопічне (а можливо і ретроградне ілеоскопічне) обстеження за допомогою відеоколоноскопа. Хоча було прийнято до 30 пацієнтів, і їх біопсія підтримувалась на рівні -80 ° C, лише ті пацієнти, у яких спостереження було повним, а діагноз ІТБ або CD підтверджений для протеомічного дослідницького аналізу. Оскільки це дослідження було пілотним дослідницьким дослідженням, ми включили 15 пацієнтів у дослідницьку фазу та 52 пацієнта у фазу перевірки.

Біологічна проба

Під час колоноскопії було задокументовано сегментарне залучення товстої кишки. Було отримано декілька біопсій слизової оболонки, включаючи п’ять-шість шматочків з макроскопічно аномальної ділянки (виразки, вузлуватість) та два-три шматочки з біопсії з ендоскопічно нормальних ділянок. Чотири шматочки біопсії фіксували окремо у 10% забуференному формаліні для гістологічних ознак. Після адекватної фіксації парафінові блоки обробляли. З кожного блоку для детальної морфологічної оцінки було підготовлено 20 крокових ділянок товщиною 4 мкм. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином та обстежували двоє патологоанатомів, що особливо цікавили патологію шлунково-кишкового тракту, які були засліплені клінічними даними та остаточними діагнозами пацієнтів. Для протеомічного дослідження було отримано 6-8 біопсій слизової з найбільш ураженої ділянки товстої кишки, переважно з правої сторони товстої кишки та ілеоцекального клапана. Біопсії із нормальної слизової оболонки товстої кишки також були взяті у пацієнтів з ІТБ в якості контролю. Ці біопсії швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C.

Діагностичні критерії для CD та ITB

Діагноз CD був поставлений на підставі рекомендацій Європейської організації з хвороби Крона та коліту, що є поєднанням клінічних, ендоскопічних та гістологічних особливостей 22. Діагноз ІТБ ставили на підставі характерних клінічних ознак (біль у животі, запор та/або діарея, конститутивні симптоми та кишкова непрохідність), ендоскопічних ознак (залучення ілеоцекалів, виразки, вузлуватість та звуження), гістологічних ознак (наявність гранульом), мікроби), мікроби), (наявність кислотостійких паличок для дослідження покриття або демонстрації кислотостійких палиць за допомогою полімеразної ланцюгової реакції) та відповідь на протитуберкульозне лікування (паустівські критерії з модифікацією Логана) 23, 24 .

Підготовка зразка для маркування iTRAQ та сильної катіонообмінної хроматографії

Стіл в натуральну величину

Катіонообмінну хроматографію проводили за допомогою системи рідинної хроматографії (Shimadzu, Кіото, Японія). Суміш пептидів розбавляли 1 мл буфера А (10 мМ фосфату калію, 25% ацетонітрилу, рН 2,9) і наносили на катіонну колонку 2,1 мм х 150 мм, що містить 5 мкм частинок і розмір пор 300 мкм (ZORBAX SCX 300; Agilent) Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Пептиди елюювали зі швидкістю 300 мкл/хвилину з градієнтом 0% буфера В (1 М KCl, 10 мМ фосфату калію, 25% ацетонітрилу, рН 2,9) протягом 10 хвилин, 0 - 30% буфера В протягом 25 хвилин, 30 - 60 % буфера B протягом 10 хвилин, 60 - 100% буфера B протягом 5 хвилин. Потім систему витримували в 100% -ному буфері B протягом 10 хвилин до врівноваження 0% -ним буфером B протягом 30 хвилин до наступного введення. Щохвилини збирали тридцять фракцій. Моніторинг елюції поєднували шляхом вимірювання поглинання при 220 нм і сушили у вакуумі.

Ідентифікація та кількісна оцінка білків

Пептиди з кожної фракції катіоніту ресуспендували в 0,1% мурашиної кислоти та 3% ацетонітрилу та вводили в систему нано-LC (TempoTM; Siex, Framingham, MA, USA), оснащену колоною C18-75 мкм x 150 мм. (Michrom Bioresources, Inc., США). Зразки знесолили через Інтернет і для розділення пептидів використовували градієнт 84 хвилини зі збільшенням концентрації ацетонітрилу. Елюент розпорошували на тандемний мас-спектрометр (QSTAR XL; Siex, Фремінгем, Массачусетс, США) та аналізували в режимі інформаційно-залежного збору (IDA) за допомогою програмного забезпечення (Analyst QS 1.1; Siex, Framingham, MA, USA). Енергію зіткнення встановлювали із значенням перехоплення на +4, що перевищує значення, яке зазвичай використовується для пептидів, щоб забезпечити достатню фрагментацію пептиду та генерацію репортерних груп iTRAQ.

Біоінформатичний аналіз

Номери доступу ідентифікованих білків Swiss Prot використовувались для отримання анотацій генної онтології з аналізу білків за допомогою системи класифікації Evolutionary Relationships (PANTHER). Потім проводили аналіз функції білка та субклітинної локалізації з використанням інформації про онтологію генів, а графіки створювали за допомогою класифікаційної системи PANTHER (//pantherdb.org; версія 9.0). База даних PANTHER була ідеальною для високопродуктивного функціонального аналізу наборів даних ідентифікованих білкових послідовностей.

імуногістохімія

Зрізи вирізали з архівних парафінових блоків біопсії товстої кишки, депарафінізували та регідратували. Потім ендогенну пероксидазну активність блокували за допомогою 3% перекису водню (H 2 O 2) та 0,1% протеази, перетравленої протягом 2 хвилин при кімнатній температурі. Потім зрізи інкубували з первинними антитілами (Abcam, Великобританія) та інкубували протягом ночі при 4 ° C. Первинні антитіла проти трифазного фактора-3 (TFF3; 1: 200), тіоредоксину (TRX; 1: 500), трансгеліну (SM22; 1: 200), тропоміозин (TPM; 1:50), IgGFc-зв’язуючий білок (FCGBP; 1): 200) та міозин (MYH; 1: 100) були використані для підтвердження результатів протеомного аналізу, оскільки ці білки виявились диференційовано виражаються у запаленій слизовій оболонці хворих на CD та ITB.

Потім предметні стекла тричі промивали сольовим розчином, забуференним Tris (рН 7,6), і, нарешті, інкубували протягом 30 хвилин з універсальним вторинним антитілом (BioCare Universal Kit, MACH4, Concord, Каліфорнія, США). Реакцію антиген-антитіло візуалізували за допомогою реакції пероксидаза-субстрат із використанням 3,3'-діамінобензидину (DAB) в якості хромогену. Під час інтерпретації напівкількісна оцінка проводиться з урахуванням загальної площі вираження фарбування та інтенсивності фарбування. Ступінь фарбування білка оцінювали від 1 до 4, а інтенсивність фарбування - від 1 до 3. Потім бали множили разом, а остаточний бал класифікували так: 1 до 3, слабке фарбування; 4 - 8, слабке забарвлення; і 9 - 12, сильне забарвлення. Точний аналіз Фішера проводили для оцінки розподілу оцінки імунохімічної експресії білка.

результат

Протеомічні експерименти

Стратегія, використана для протеомічного аналізу в цьому дослідженні, показана на малюнку 1. Зразки колоректальної біопсії від 15 пацієнтів (5 з ІТБ, КД та контролем) використовували відповідно до моделі, наведеної в таблиці 1. Всього в п’яти експериментах було виявлено 533 білки і 241 білок серед них був кількісно визначений, з критеріями щонайменше двох пептидів були визначені кількісно в талісмані. Сто тридцять вісім білків були ідентифіковані та кількісно визначені принаймні у двох наборах експериментів (табл. 2). Результати п'яти наборів експериментів були порівнянні з точки зору загальної кількості ідентифікованих та кількісно визначених білків, а частота помилкових спрацьовувань була стабільно низькою. Гемоглобін все ще виявлявся загальним явищем. Біоінформатичний аналіз всіх ідентифікованих білків проводили в PANTHER. Детальний генний онтологічний аналіз цих білків показаний на фіг.

Блок-схема ілюструє кроки, включені до наборів з 1 по 5 аналізу iTRAQ.

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

( A ) Кругова діаграма, що показує розподіл генетичної онтологічної анотації всіх білків, виявлених під час макроскопічно ураженої біопсії слизової оболонки товстої кишки при аналізі протеомів. Білки згруповані відповідно до їх молекулярної функції. ( Б) Кругова діаграма, що показує розподіл анотації генної онтології всіх білків, виявлених у макроскопічно ураженій слизовій оболонці товстої кишки під час аналізу протеомів. Білки групуються відповідно до відомих біологічних процесів, в яких вони беруть участь. ( C. ). Кругова діаграма, що показує розподіл анотації генної онтології всіх білків, виявлених у макроскопічно ураженій слизовій оболонці товстої кишки під час аналізу протеомів. Білки згруповані відповідно до розподілу клітин.

Повнорозмірне зображення

Диференціальна експресія білка в макроскопічно ураженій слизовій оболонці товстої кишки пацієнтів з ІТБ порівняно з контрольними біопсіями

П'ятдесят один білок диференційовано експресувався в біопсіях пацієнтів з ІТБ з посиланням на контролі з критеріями співвідношення iTRAQ 1,3, принаймні в одній серії експериментів iTRAQ. Двадцять три білки були недостатньо експресованими в ITB, а 28 білків були надмірно виражені щодо контролю. Серед тих білків, які були ідентифіковані в більш ніж одному експерименті, чотири білки (міозин-11, інгібуючий фактор міграції макрофагів, гетерогенний ядерний рибонуклеопротеїн А1, подібний до 2, і міозин-10) були значно недоекспресованими (значення р).

( A ) Білки, недоекспресовані у хворих на CD порівняно з білками ІТБ. ( B ) Білки з надмірною експресією у хворих на CD порівняно з білками ІТБ.

Повнорозмірне зображення

Біоінформатичний аналіз

Біоінформаційний аналіз над-експресованих та недоекспресованих білків проводили в PANTHER. Молекулярна функція, біологічний процес та клітинне розташування цих білків були подібними до загального білка, що охоплюється. Аналіз шляхів цих диференційовано експресованих білків проводили в PANTHER. Різні шляхи, з якими, ймовірно, беруть участь ці по-різному експресовані білки, показані на малюнку 4. Подекспресивні білки були анотовані для метаболізму фруктози галактози, сигнального шляху апоптозу, каскаду, що активує плазміноген, хвороби Паркінсона, рецептора гонадотропіну, що вивільняє гормон, гліколізу. та шляхи згортання крові. З іншого боку, надмірно експресовані білки були анотовані до шляхів, включаючи регуляцію цитоскелета, запалення, сигнальний шлях інтегрину, гіпоксію, реакцію на окислювальний стрес, сигнальний шлях FAS та сигнальний шлях G-білка.

( A ) Кругова діаграма, що демонструє анотацію генної онтології та розподіл шляхів недоекспресії білків у макроскопічно ураженій слизовій оболонці хворих на CD та ITB. (B) Кругова діаграма, що демонструє анотацію генної онтології та розподіл шляхів надмірно експресованих білків у слизовій макроскопічно уражених хворих на CD та ITB.

Повнорозмірне зображення

Валідація диференційовано експресованих білків за допомогою імуногістохімії

Стіл в натуральну величину

Мікрофотографія, що демонструє нормальний профіль експресії трифакторного фактора-3 [( A ), IHC [TFF3] x40), IgGFc-зв’язуючий білок [стрілка] ( B ), IHC [FCGBP] x40), стрілка міозину (( C. ), IHC [MYH] x40), трансгелін (( D ), IHC [SM22] x40), тропоміозин (( Е ), IHC [тропоміозин] x40) і білок тіоредоксин [стрілка] ( F ), IHC [TRX] x40). Порівняльні закономірності експресії трифакторного фактора-3 в біопсіях товстої кишки:( G ), що показує показники експресії фактору 3-фактора 3 (12 (( G ), IHC [TFF3] x40), оцінка виразу 6 (( H ), IHC [TFF3] x40) та оцінка вираження 0 (( Я ), IHC [TFF3] x40).

Повнорозмірне зображення

обговорення

Це дослідження є першим протеомічним аналізом біоптатів слизової оболонки пацієнтів із CD та ITB та виявило кілька перспективних кандидатів на біомаркери для розрізнення двох захворювань. У п’яти наборах експериментів iTRAQ було виявлено 533 білка та визначено кількісно 241 білок. Загалом, 63 пацієнти на слизовій оболонці товстої кишки з CD та ITB пацієнтами диференційовано експресувались щонайменше в одній серії експериментів iTRAQ, з яких 11 білків диференційовано експресувались у більш ніж одному наборі експериментів. З них ми припускаємо, що трифакторний фактор 3, синтаза жирних кислот, міозин 14, міозин 11, тіоредоксин 1 людини, IgG-зв’язуючий білок Fc, трансгелін та тропоміозин є потенційними кандидатами для розробки біомаркерів для розрізнення CD та ITB.

Білки, які диференційовано експресуються в товстій кишці у хворих на CD та ITB, можуть відігравати певну роль у патогенезі захворювання або можуть з’являтися в тканині в результаті цих захворювань. Наприклад, суттєво нижчі рівні фактора трилисника 3 у пацієнтів із ЦД, ймовірно, є показником активності захворювання. Незважаючи на те, що ми включили як CD, так і ITB в їх активну фазу, по-різному нижча експресія пептиду-трилистка у пацієнтів із CD порівняно з ITB відображає більшу площу ураження слизової оболонки у пацієнтів із CD. В одному з наших інших досліджень ми спостерігали більш високий рівень сироваткового фактора трилисника 3 у пацієнтів із вилікуваним виразковим колітом порівняно з пацієнтами з активним захворюванням 25. Обидва ці спостереження свідчать про те, що фактор трилистя 3 може бути хорошим показником активності захворювання. Трилисник фактор-3 є одним із трьох невеликих, компактних білків, що експресуються келихоподібними клітинами в шлунково-кишковому тракті 26. Окрім своїх протизапальних властивостей, пептид трилисника також відіграє важливу роль у підтримці та відновленні слизової шлунково-кишкового тракту. Експресія трилисника пригнічується фактором некрозу пухлини-α, рівень якого залишається високим у пацієнтів з CD27.

Хоча дистальна та кінцева клубова кишки беруть участь як у CD, так і в ITB, кількість ураження слизової більша у пацієнтів із CD, ніж у ITB. 4-кратне збільшення експресії синтази жирних кислот у хворих на ЦД порівняно зі збільшенням ІТБ може бути частково пов’язано із вищим зміною метаболізму жиру та ентерогепатичної циркуляції жовчних кислот у хворих на КД, ніж у ІТБ 28, 29, 30 .

На закінчення, порівняльний аналіз протеомного профілю біоптатів товстої кишки з макроскопічно уражених ділянок товстої кишки пацієнтів із CD та ITB дав 533 білка, з яких 241 білок можна було визначити кількісно. Білки диференційовано експресувались у тканинному білку пацієнтів із CD та ITB. Подальші експерименти з використанням більшої когорти однорідних зразків тканини потрібні для пошуку біомаркера для розрізнення CD та ITB.

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Rukmangadachar, LA та ін. Білковий аналіз макроскопічно ураженої слизової оболонки товстої кишки при хворобі Крона та туберкульозі кишечника. Наук. Респ. 6, 23162; doi: 10, 1038/srep23162 (2016).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.