ptpn2

  • предметів
  • реферат
  • ВСТУП
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Специфічна для Т-клітин втрата PTPN2 посилює запалення кишечника
  • Втрата PTPN2 призводить до змінених перетворювачів сигналів та активаторів транскрипційного (STAT) фосфорилювання та експресії фактора транскрипції Т-клітин.
  • Підвищений рівень клітин Th1 і Th17 у товстій кишці, MLN та селезінці мишей з дефіцитом PTPN2
  • Втрата PTPN2 в Т-клітинах призводить до інфільтрації Т-лімфоцитів в органи поза кишечника та аутоімунних реакцій
  • Втрата PTPN2 викликає дисбактеріоз кишечника
  • Наявність CD-асоційованого варіанту PTPN2 призводить до збільшення експресії генів, асоційованої з Th1 і Th17, у біоптатах кишечника хворих на ВЗК.
  • ОБГОВОРЕННЯ
  • методи
  • Індукція мишей та коліту
  • Оцінка тяжкості коліту та гістологічний бал
  • В пробірці Диференціація Th-клітин
  • Аналіз мікробіоти
  • Зразки пацієнтів
  • Статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткові зображення
  • Документи Word
  • Додаткові рисунки Легенди та методи

предметів

  • Хвороба Крона
  • дисбактеріоз
  • Імунологія слизової оболонки
  • Т-клітини

реферат

Регулювання диференціації Т-клітин-помічників (Th) на популяції ефекторних Т-клітин має важливе значення для підтримки толерантності до власних антигенів, а також до нешкідливих несамогенних антигенів, таких як похідні частинок їжі або коменсальних бактерій у кишечнику та на шкіра. 1, 2 При хворобі Крона (CD), формі хронічного запалення кишечника, були описані підвищений рівень класичного Th1-цитокіну IFN-γ, а також Th17-цитокіни IL-17A/F та IL-22 в кишечнику. біопсія та сироватка, 3, 4, 5, 6, що передбачає нерівномірність проліферації Th-клітин як механізм управління захворюваннями. Виділяючи специфічні цитокіни, Th-клітини організовують імунну відповідь (наприклад, перехід класу від IgM до IgG/IgA 7 в кишкових В-клітинах або посилення секреції антимікробних пептидів з клітин епітелію кишечника) до коменсальних і патогенних бактерій, впливаючи тим на склад кишкова флора. Зміни мікробіотичного складу були пов’язані із захворюваннями кишечника. 8

РЕЗУЛЬТАТИ

Специфічна для Т-клітин втрата PTPN2 посилює запалення кишечника

Втрата PTPN2 призводить до змінених перетворювачів сигналів та активаторів транскрипційного (STAT) фосфорилювання та експресії фактора транскрипції Т-клітин.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Підвищений рівень клітин Th1 і Th17 у товстій кишці, MLN та селезінці мишей з дефіцитом PTPN2

Збільшення інфільтрації лімфоїдних клітин та збільшення тяжкості коліту разом із посиленою активацією STAT1/STAT3 призвели нас до рішення, якщо втрата PTPN2 у Т-клітинах призводить до зміни диференціації Th-клітин. Ми не виявили різниці у співвідношенні CD8 + проти CD4 + Т-клітини між мишами PTPN2 fl/fl та PTPN2 fl/fl xCD4Cre (дані не показані).

Ін'єкція наївних CD4 + Т-клітин у мишей RAG -/- призвела до стійкої індукції IFN-γ +, а також клітин IL-17 + у кишковій групі CD4 + Т-клітин. Хоча індукція клітин IFN-γ + була слабкою, а індукція клітин IL-17 + була низькою у мишей, які отримували PTPN2-компетентні Т-клітини, ін’єкція наївних дефіцитних PTPN2-клітин призводила до масивного рівня IFN-γ + та індукції IFN . -y/IL-17 подвійні позитивні CD4 + Т-клітини (рис. 3а). На відміну від них, FoxP3 +/CD25 високорегуляторні Т-клітини (Tregs) були сильно індуковані у мишей, які отримували PTPN2-компетентні Т-клітини, але лише незначно у мишей, які отримували PTPN2-дефіцитні Т-клітини (рис. 3b).

Спостережувані зміни в розвитку клітин Th не обмежуються лише пластинкою товстої кишки, оскільки ми виявили подібні зміни у популяціях IFN-γ + та IFN-γ +/IL17 + CD4 + та Treg у MLN та селезінці з будь-якого PTPN2 fl/fl. тварини xCD4Cre або миші Rag2 -/-, які отримують Т-клітини з дефіцитом PTPN2 (Фігура 3a, Додаткова Фігура 7 a + b). Ці спостереження вказують на індукцію прозапального фенотипу Т-клітин у стимулюючому запалення дисфункції PTPN2 у людини.

Втрата PTPN2 в Т-клітинах призводить до інфільтрації Т-лімфоцитів в органи поза кишечника та аутоімунних реакцій

Це демонструє, що втрата PTPN2 у Т-клітинах впливає на склад кишкової мікробіоти в бік мікробіотичного дисбіозу, який подібний до складу хронічного запалення кишечника людини, наприклад CD. Під час запалення кишковий дисбіоз, як видається, погіршується у мишей PTPN2 fl/fl xCD4Cre і може сприяти загальному збільшенню тяжкості коліту у цих тварин. Однак, оскільки було проаналізовано обмежену кількість шести мишей на групу, наші дослідження посилили б подальші дослідження.

Наявність CD-асоційованого варіанту PTPN2 призводить до збільшення експресії генів, асоційованої з Th1 і Th17, у біоптатах кишечника хворих на ВЗК.

Зміни, що спостерігаються у мишей, відповідають ситуації у пацієнтів з CD гомозиготним за нефункціональним варіантом SNP rs1893217 C. У цих пацієнтів ми виявили підвищений рівень Th1 і Th17-асоційованих генів, але знизили регуляторні та Th2-асоційовані транскрипти генів у біопсія із запалених ділянок. Однак у зразках пацієнтів зміни гена/цитокінів, пов'язані з Th17, були більш вираженими, ніж у мишей. PTPN2 відіграє важливу роль у цілісності епітеліальних клітин 33 та секреції цитокінів з антигенпрезентаційних клітин (APC); 31, 34, таким чином, більш виражений фенотип Th17 у пацієнтів може відображати дисфункціональний PTPN2 не тільки в Т-клітинах, але й у всіх типах клітин, присутніх в кишечнику. Ми виявили підвищений рівень експресії IL-13 та IL-10 у пацієнтів із CD з WT. Ці цитокіни пов'язані з підвищеним рівнем клітин Th2 та Treg; підмножини клітин не вважаються причинами запалення в CD. Однак кишкове запалення, яке спостерігається при CD, сприяє накопиченню Th-клітин загалом, що може пояснити спостережуване збільшення цих двох цитокінів.

Збільшений потенціал дефіцитних PTPN2 клітин ТТР, схоже, не обмежений кишечником, оскільки миші, у яких відсутній PTPN2 у Т-клітинах, виявляють запальні інфільтрати в печінку, а згодом у нирки та шкіру. Незважаючи на те, що він залучений до кількох запальних захворювань, не повідомлялося про кореляцію між варіантами PTPN2 та шкірними захворюваннями. Однак, що стосується CD, ці спонтанні запальні інфільтрати дуже цікаві, оскільки прояви позакишкових захворювань є загальним ускладненням CD. 35 Однак можлива кореляція між варіантами PTPN2 та кишковими проявами ще не розглядалась. Наші дані свідчать про те, що ураження шкіри та нирок є результатом загальної втрати толерантності до втрати Т-клітин-специфічного PTPN2. Це вказує на важливість PTPN2 у регуляції Т-клітинного гомеостазу внаслідок декількох опосередкованих Т-клітинами аутоімунних та запальних розладів. Оскільки ми раніше показували, що активації PTPN2 достатньо для полегшення гострого коліту, спричиненого DSS, у мишей36, наші результати можуть прокласти шлях до абсолютно нового варіанту лікування багатьох хронічних запальних та аутоімунних захворювань, таких як CD, ревматоїдний артрит, тип 1 цукровий діабет. целіакія, псоріаз або системний червоний вовчак.

У сукупності ми демонструємо, що втрата PTPN2 у Т-клітинах призводить до просування патогенних підмножин Т-хелперів, що призводить до посиленої сприйнятливості до запалення кишечника. Більше того, втрата PTPN2 призводить до загальної втрати толерантності у літніх мишей, як правило, не схильних до аутоімунної дії B6/C57, що призводить до запальних інфільтратів у багатьох органах. Наші висновки, отримані на мишах, схожі на хворих на КР із CD-асоційованим варіантом гена, а дисбактеріоз кишечника на наших моделях мишей тісно корелює з тим, що спостерігається у хворих на КР. Ці спостереження підтверджують вирішальну роль PTPN2 у патогенезі хронічних запальних захворювань та, зокрема, CD, і припускають, що дисфункція PTPN2 може бути однією з рушійних сил хронічного запалення та аутоімунітету у людини.

методи

Індукція мишей та коліту

Мишей CD4Cre на фоні B6/C57 було придбано у Taconic (Кельн, Німеччина), мишей RAG2 -/- від Janvier (Saint-Bellevin Cedex, Франція), PTPN2 fl/fl від EUCOMM. Мишей, у яких відсутній PTPN2 у Т-клітинах, генерували шляхом схрещування мишей PTPN2 fl/fl з тваринами CD4Cre. Усі миші, що використовувались для експериментів, були самками і утримувались у конкретному закладі, вільному від патогенів, і експерименти проводились із дозволу місцевого органу з питань захисту тварин, а саме Ветеринарного управління кантону Цюріх, Швейцарія. Для переносного коліту наївні Т-клітини виділяли за допомогою наївного ізолятора Т-клітин Miltenyi II (Miltenyi, Gladbach, Німеччина) та 2,5 × 10 5 клітин, що вводили ip в RAG2 -/- господарів. Чистота наївних Т-клітин (визначена як CD4 +/CD62L висока/CD44 низька/CD25 - клітина) становила> 94%, як аналізували за допомогою проточної цитометрії. Гострий коліт DSS був викликаний введенням 2,5% DSS (MP Biomedicals, Карлсбад, Каліфорнія) у питну воду протягом 7 днів. Мишей вбивали на 10-й день. Хронічний коліт DSS був індукований введенням чотирьох циклів, що складалися з 7 днів 2% DSS, а потім 10 днів нормальної питної води. Мишей вбивали через 4 тижні після останнього циклу DSS. Для всіх експериментів використовували контроль сміття.

Оцінка тяжкості коліту та гістологічний бал

Тваринам знеболювали внутрішньовенно внутрішньовенним введенням кетаміну 90–120 мг кг -1 маси тіла (Ветохінол, Берн, Швейцарія) та 8 мг кг -1 маси тіла Ксилазину (Bayer, Lyssach, Швейцарія). Тварин обстежували, як описано раніше. 44 Запис виконувався за допомогою Karl Storz Tele Pack Pal 20043020 (ендоскоп Karl Storz, Тутлінген, Німеччина). Колоноскопію оцінювали за допомогою мишачої ендоскопічної індексу тяжкості коліту (MEICS), як описано раніше 44, використовуючи наступні п'ять параметрів: (i) прозорість товстої кишки, (ii) зміни судинного малюнка, (iii) фібрин видимий, ( iv) зернистість слизової поверхні та (v) консистенція стільця. Гістологічний бал за запальну інфільтрацію та пошкодження епітеліальних клітин проводили на гематоксиліні та пофарбованому еозином зрізі найбільш дистального 1 см товстої кишки миші. 44, 45

Диференціація Th-клітин in vitro

Наївні Т-клітини виділяли за допомогою наївного Т-клітинного набору Miltenyi II. Чистота була> 97%, як аналізували за допомогою проточної цитометрії. Для диференціації Th 0,5 × 10 6 клітин на мл стимулювали 1 мкг мл -1 зв'язаного з пластиною анти-CD3 та 1 мкг мл -1 розчинного анти-CD28 під Th1-перекосом (10 нг мл -1 ІЛ-12, 10 нг мл -1 IFN-γ плюс 10 мкг мл -1 анти-IL-4), Th2-перекіс (10 нг мл -1 IL-4, 10 мкг мл -1 анти-IFN-γ плюс 10 мкг мл -1 анти -IL-12), Th17-перекіс (1 нг мл -1 TGFβ1, 10 нг мл -1 IL-6, 10 мкг мл -1 анти-IL-4, 10 мкг мл -1 анти-IFN-γ плюс 10 мкг мл -1 анти-IL-12), або перекос Трега (3 нг мл -1 TGFβ1, 20 нг мл -1 IL-2, 10 мкг мл -1 анти-IL-4, 10 нг мл -1 анти-IFN -γ плюс 20 мкг мл -1 анти-IL-12) в середовищі RPMI 1640 (Life Technology, Карлсбад, Каліфорнія), доповненому 2% фетальною телячою сироваткою та пеніцилін-стрептоміцином (Sigma, Buchs, Швейцарія).

Аналіз мікробіоти

Високопродуктивне секвенування проводили на ДНК сліпої кишки за допомогою системи 454 Life Sciences у поєднанні з хімією титану (Roche AG, Базель, Швейцарія). Секвенування та аналіз проводили в Microsynth (Балгах, Швейцарія). Орієнтована гіперваріативна область 16S рРНК V3 - V5. Кількість ампліконів визначали за допомогою набору для аналізу dsDNA Quant-iT PicoGreen (Life Technologies). Таксономічна класифікація для кожного прочитання була проведена з використанням Мотура на основі байєсівського методу, 46 з використанням розміру кмерів 8 п.н. та 1000 повторень. В якості еталонних баз даних використовували референтну таксономію Грінгенеса (оновлена ​​в червні 2013 року) 47 та референтну таксономію Сільви 48. Значення початкової стрічки нижче граничного значення 70% були позначені як некласифіковані.

Зразки пацієнтів

Зразки кишкової тканини були взяті за допомогою ендоскопії з макроскопічно запалених, а також незапалених ділянок кінцевої клубової кишки, товстої кишки або прямої кишки у хворих на ЦД (дикий тип (TT): n = 15, віковий діапазон: 27–66, середній: 47,4 ± 13,5 років; варіант (CC): n = 8, віковий діапазон: 28–69, середнє значення: 43,8 ± 18,3 року), а також у пацієнтів, які не контролювали IBD (n = 8, віковий діапазон: 37–61, середній: 49,1 ± 9,5). Контрольні пацієнти протікали безсимптомно і були представлені для скринінгу на рак товстої кишки. Письмова інформована згода була отримана до того, як місцевий комітет з питань етики затвердив зразки та дослідження. Пацієнтів визначали за віком, статтю та активністю захворювання. Генотип PTPN2 для CD-асоційованого SNP rs1893217 визначали за допомогою технології TaqMan (Life Technologies), як описано раніше. 31

Статистичний аналіз

Якщо не зазначено інше, дані є репрезентативними для одного з двох незалежних експериментів з n повторностями кожного, дані представлені як середня та стандартна похибка середнього значення. Статистичну значимість визначали за допомогою критерію Вілкоксона-Манна Уітні.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткові зображення

Документи Word

Додаткові рисунки Легенди та методи

Внески автора

MRS проводив експерименти, аналізував дані та писав перший проект рукопису; SK, CG, TR, IF, SL та KA проводили експерименти та брали участь в аналізі даних; FM та BB були залучені до аналізу проточної цитометрії; CC та CL провели аналіз мікробіоти; SRV, MF, GR та MS були залучені до отримання зразків пацієнтів; MS задумав, спроектував та контролював дослідження. Усі автори написали, виправили та схвалили рукопис.