реферат
Розмноження, розповсюдження та розселення є основними популяційними процесами і є критичними етапами життєвого циклу організму. У симбіотичних організмів, таких як лишайники, що складаються з популяцій грибів та фотобіонтів, розмноження є складним процесом. Хоча багато лишайників здатні розмножуватися як статевим, так і безстатевим шляхом, ступінь вегетативного розмноження у місцевих популяцій невідома. Ми використали шість поліморфних мікросупутникових локусів, щоб визначити, чи поширена рекомбінація в природних популяціях, і чи впливає клональне розмноження і як просторово-генетична структура епіфітних популяцій лишайників Lobaria pulmonaria. Високе генетичне різноманіття у всіх 12 досліджених популяціях та докази рекомбінації, отримані в результаті різних тестів, показали, що L. pulmonaria переважно перевершує види. Однак клональність мала місце у всіх популяціях, але наявність багаторазових багатозакритих генотипів впливала на просторову генетичну структуру лише у популяціях низької щільності. Це можна трактувати як показник генетичних вузьких місць через збільшену втрату середовища проживання та порушення. Як результат, для видів, які переважно перетинають лишайники, екзогенні фактори можуть суттєво впливати на популяційні процеси, а отже і на генетичну структуру.
Просування по службі, будь то статеве чи безстатеве, є основним етапом життєвого циклу кожного окремого організму. Статеве розмноження збільшує кількість різних генотипів у популяціях і збільшує ймовірність виживання в конкурентному та/або мінливому середовищі (Maynard Smith, 1978; Balloux et al., 2000), тоді як безстатеве поширення може бути успішною стратегією розвитку для адаптовані генотипи в екстремальних, але стабільних середовищах існування (Murtagh et al, 2000). Хоча наші знання про системи і схеми спарювання у тварин і рослин є широкими (наприклад, Jackson et al., 1996; Takebayashi and Morrell, 2001), ми лише почали вивчати та розуміти їх у симбіотичних формах життя, таких як лишайники. Незважаючи на кілька досліджень щодо статевого розмноження у лишайників (Murtagh et al., 2000; Kroken and Taylor, 2001; Högberg et al., 2002), нічого не відомо про його значення порівняно з клональним розмноженням (за допомогою фрагментів талусу, соредії або ісидії) у природних популяціях. Отже, цілями цього дослідження було (i) дослідити, чи є рекомбінація, а отже, аутбридинг, поширеним у природних популяціях лишайників, та (ii) визначити, як клональне розмноження впливає на просторову генетичну структуру популяцій.
Матеріали і методи
Folios епіфітний лишай L. L. pulmonaria (L.) Hoffm. вона широко поширена в прилеглих районах Північної півкулі та в Південній Африці (Йошимура, 1971, 1998а, 1998b). Хоча L. pulmonaria широко поширений і все ще поширений у Північній Америці (Brodo et al, 2001), він вважається зникаючим у багатьох частинах Європи (Wirth et al., 1996). Незважаючи на те, що його описують як вид, що розмножується статевим та клональним шляхом, апоки (плодові тіла із статевими пропагулами) часто формуються, а популяції з обмеженою кількістю грибкових генотипів виглядають нестатевими (Zoller et al, 1999). Ця кореляція між генотиповим різноманіттям і родючістю інтерпретована як доказ того, що L. pulmonaria може бути самостерильною (гетеротальна; Zoller et al., 1999).
Відбір проб
Всього було зібрано 562 тальків L. pulmonaria з дев'яти популяцій Британської Колумбії, Канада та трьох популяцій Швейцарії (табл. 1). Ми вважали популяцію ділянкою дерев, колонізованих L. pulmonaria. За периметром ділянки цей вид не був місцевим. Зразки з Британської Колумбії збирали у трьох різних зонах (гіпермарі, морський та міжгірський; Говард, 1999) для міграції з південного узбережжя острова Ванкувер у внутрішню частину провінції. Ці популяції траплялися або в старовинних лісах (наприклад, CS, PR, DC, CL, BL або OC) або в густих непорушених лісах (AY, TO та BC). Зразки зі Швейцарії були зібрані у відносно великих, але малонаселених популяцій в Приалпах і горах Юра, де антропогенні порушення були мінімальними. У всієї популяції один таллом на дерево було випадковим чином відібрано у вибраних найближчих сусідніх дерев. Вимірювали відстань між деревами-господарями, розраховували площу місцевої популяції (табл. 2) та визначали кількість зразків з апотецією.
Стіл в натуральну величину
Стіл в натуральну величину
Мікросателітний аналіз
ДНК виділяли згідно Walser et al. (2003) з приблизно 20 мг очищених крайових часток на талус. Було вивчено шість мікросупутникових локусів (LPu03, LPu09, LPu15, LPu16, LPu20 та LPu27; Walser та співавт., 2003), а чотири оригінальні праймери були перероблені з метою зменшення розмірів алелів або уникнення появи інделів у фланкуючих областях. (Таблиця 3). Сайти посилювались у двох мультиплексних ланцюгових реакціях полімерази (ПЛР), кожна з яких містила три пари праймерів (LPu03/LPu09/LPu15 та LPu16/LPu20/LPu27). Подальша ампліфікація та аналіз фрагментів за допомогою автоматизованого капілярного секвенсора слідували протоколам Walser et al. (2003). Оскільки ДНК була виділена з матеріалу талусу, частка грибкової ДНК була невідомою і варіювала між зразками. 3 мкл екстракту геномної ДНК використовували в кожній реакції ампліфікації 30 мкл. На додаток до Walser et al. (2003), довжини 19 алелів у локусі LPu09, які були більше 400 bp, були частково перевірені на стандартний розмір ROX-1000 (Applied Biosystems) і згодом екстрапольовані. Вибірки з відсутніми даними мікросателітів були виключені (n = 3).
Стіл в натуральну величину
Статистичний аналіз
Середнє число алелів (A) та середнє ефективне число алелів (Ae) розраховували згідно з Хартлом та Кларком (1997).
Оскільки грибковий партнер лишайників гаплоїдний і має лише один алель на локус, рекомбінаційні аналізи передбачають вивчення алельних асоціацій між різними локусами (Maynard Smith et al., 1993). Панміксія означала б, що алелі в усіх локусах, крім фізично близьких локусів, були випадково пов'язані між собою. Однак навіть гени в різних хромосомах можуть відхилятися від випадкової асоціації через різні фактори, такі як генетичний дрейф, відбір, клональне розмноження та/або невідповідне спаровування (Lewontin, 1988). Ми використовували тест χ 2 із значеннями P, розрахованими шляхом перестановок Монте-Карло з 10000 реплік та модифікованими методом Хоммеля для багаторазового порівняння (Hommel, 1988), щоб перевірити наявність значущої асоціації між парами локусів на популяцію ( с. Без повторення генотипів). Ми також розрахували нормований показник загального дисбалансу, описаний Хедріком (1987) та розширеним тестом ймовірності імовірності Фішера за нульовою гіпотезою про відсутність зв'язку між двома тестованими локусами на одну популяцію, як реалізовано в ARLEQUIN (Schneider et al, 2000).
Ми також використовували стандартизований індекс асоціації (IA) (Maynard Smith et al., 1993) для контролю рекомбінації або клональності в популяціях. Спостережуване відхилення (VD) було розраховано на основі розподілу значень невідповідності та порівняно з очікуваним відхиленням (Ve) нижче рівноваги (Maynard Smith et al., 1993; Haubold et al., 1998; Haubold and Hudson, 2000). Нульову гіпотезу (I A = 0, тобто випадкова асоціація алелів) перевіряли за допомогою 1000 перестановок, а значення P знову коригували методом Hommel (1988). Ці обчислення проводились один раз без повторюваних генотипів.
Якщо гриб, що утворює лишай, розмножується клонально (за допомогою мітозу) або гомоталічним спаровуванням, весь геном ефективно зв’язується, оскільки немає сегрегації та не відбувається пересортування алелів. Крім того, ми розрахували попарне порівняння мікросателітних локусів на додаток до мультилокусних асоціацій, описаних вище. Відсутність асоціації між будь-якою парою локусів можна трактувати як наслідок рекомбінації, тоді як зв'язування або гомоплазія може спричинити відхилення від очікуваних генотипових частот у випадковому спарюванні на деяких парах локусів.
Просторова генетична структура популяцій була проаналізована на основі багатолокусних генотипів (Smouse and Peakall, 1999) за допомогою GENALEX (Peakall and Smouse, 2001) для дослідження ефекту розсіювання вегетативних та статевих пропагул. Ми провели просторовий автокореляційний тест для класу відстаней з однаковими розмірами зразків і використали послідовну мутаційну модель, засновану на відмінностях між двома генотипами (Слаткін, 1995), яка базується на різниці в сумі між двома генотипами (Слаткін, 1995 ). Просторовий автокореляційний аналіз проводили двічі: один раз і один раз без повторюваних генотипів. Відхилення від нульової гіпотези H 0: r = 0 визначалось 1000 перестановок. На додаток до цього аналізу ми також перевірили кореляцію між географічними та генетичними відстанями у популяціях L. pulmonaria за допомогою тестів Мантеля з 1000 перестановок, розрахованих за допомогою пакету R.
Коефіцієнти кореляційної кореляції Спірмена використовувались для оцінки зв'язку між місцевою популяцією (трансформованою в журнал) та відсотком різних генотипів (М) або родючих зразків, а також між відсотком родючих зразків та середнім числом алелів (А) або середнім ефективне число алелів (Ae).
результат
Мікросателітне розмаїття та частота апотецій
Генетична різноманітність місцевих популяцій L. pulmonaria, заснована на шести мікросателітних локусах, була високою. З 562 проаналізованих особин ми виявили 405 різних генотипів, з яких 75% траплялися лише один раз. Кількість алелей на локус і популяцію коливалася від одного для локусу LPu27 у популяції DC до 22 для локусу LPu20 у популяції BC. Середня кількість алелей на популяцію (А) коливалася від 5, 3 до 10, 5, а середня ефективна кількість алелей (Ае) - від 3, 1 до 5, 7 (табл. 2). Відсоток різних генотипів (М) був однаково низьким у популяціях Швейцарії (
50%), але становив від 52 до 92% серед населення Британської Колумбії (табл. 2). Відсоток родючих зразків (з апотецією) коливався від 0% (ультразвукова популяція) до максимум 42% (популяції CS та PR; таблиця 2). Існував значний негативний зв’язок між М та місцевим населенням (коефіцієнт Спірмена, r s =, 0, 766, P = 0,005). На відміну від цього, ми не виявили значущої кореляції між відсотком родючих зразків (апотеція) та середнім числом алелів (A) або середньою ефективною кількістю алелів (A e) або між відсотком родючих зразків та місцевим населенням.
Рекомбінація та клональність
Усі три вимірювання прив'язки дисбалансу, тест χ2, нормалізоване вимірювання загального дисбалансу Гедріка та розширений тест ймовірності ймовірності Фішера дали подібні результати. Наводяться лише результати тесту χ 2 (табл. 4). Близько 5% усіх попарних порівнянь у Британській Колумбії та 7% у Швейцарії відкинули нульову гіпотезу незалежності локусів. Результати не узгоджувались з локусами і вказували на дисбаланс зв'язування між локусами LPu 16/LPu 27 та LPu 20/LPu 27 (Таблиця 4).
Стіл в натуральну величину
В аналізі ІА парного та багатолокусного асоціативного індексу (Maynard Smith et al., 1993) та при розгляді всіх зразків нульова гіпотеза (тобто відсутність асоціації між двома локусами) була відхилена у 32 та 69% усіх парних порівнянь у Населення Британської Колумбії та Швейцарії (Таблиця 5а). За винятком повторюваних генотипів, нульову гіпотезу було відкинуто лише в парних порівняннях 5% для Британської Колумбії та 4% для Швейцарії (таблиця 5b). Відповідно до вищезазначеного аналізу нерівноважних зв’язків, трохи вище значення значень ІА суттєво відрізнялося від нуля для локусів LPu 16, LPu 20 та LPu 27 (Таблиця 5b).
Стіл в натуральну величину
Просторова генетична структура
Аналіз просторової автокореляції показав різні генетичні структури у популяціях швейцарської та британської Колумбії L. pulmonaria. У швейцарських популяціях позитивні значення автокореляції (r) були знайдені в перших класах відстані, коли для аналізу були використані всі зразки (з повторюваними генотипами) (рис. 1). У популяції MT особливо високий коефіцієнт r> 0,6 був виявлений на найкоротшій відстані. Однак ця позитивна автокореляція у швейцарських популяціях зникла, коли повторні генотипи були виключені з аналізу (рис. 1). На відміну від цього, ми не виявили жодної значущої генетичної структури в жодній з дев’яти популяцій L. pulmonaria у Британській Колумбії, незалежно від того, чи були розглянуті рецидивуючі генотипи чи ні. Як приклад, відповідні корлограми для популяції TO показані на фіг.
Приклади багатолокусної просторової автокореляції у Lobaria pulmonaria; населення Швейцарії (TW, MT та UZ) та Британської Колумбії в Канаді (TO). Для кожної популяції показано дві корелограми з повторюваними генотипами та без них. 95% довірчі інтервали позначені пунктирними лініями, а значення, що суттєво відрізняються від нуля (на основі 1000 перестановок), позначені зірочкою. Зверніть увагу на різні шкали осей х відносно однакового розміру вибірки в межах класів відстані, але, отже, різні шкали на популяцію.
Повнорозмірне зображення
Відповідно до цих результатів, значні та позитивні кореляції Мантеля були знайдені лише між географічними та генетичними відстанями популяцій Швейцарії, коли були включені всі зразки (дані не наведені). Однак кореляції не були значущими, коли використовувався зменшений набір даних без повторюваних генотипів.
обговорення
рекомбінація
Загалом популяції Швейцарії мали меншу щільність талів, ніж популяції Британської Колумбії, і цілком могли б представляти залишки раніше більших, щільніших і родючих популяцій. Крім того, на взаємозв'язок між родючими зразками та ступенем генетичного різноманіття впливає цілорічний життєвий цикл лишайників та той факт, що апотеція у L. pulmonaria відбувається на пізніх стадіях життя (Ramstad and Hestmark, 2001; Denison, 2003 ). Тому не виключено, що різні вікові структури в межах досліджуваних популяцій призвели до відмінностей у спостеріганій частоті апотецій. Однак дані, наведені в Таблиці 2, дозволяють припустити, що відсоток родючих зразків на популяцію може варіюватися між Швейцарією та Британською Колумбією або навіть між зонами в межах Британської Колумбії. Ці висновки свідчать про те, що частота та розвиток апотецій регулюються екзогенними факторами, такими як океан, який, однак, плутає в нашому дослідженні висота.
Генетична структура
Недавнє дослідження летаргії вульпіни показало, що зразки з Північної Америки мали вищі генетичні варіації на восьми одиночних нуклеотидних поліморфних ділянках (SNP), ніж зразки зі Швеції чи Італії. Тому було зроблено висновок, що L. vulpina слід викреслювати в Північній Америці, але фактично клонально в Європі (Högberg et al, 2002). Аналогічно, наші дані свідчать про те, що популяції L. pulmonaria з Британської Колумбії також мають значно більше генотипів, ніж швейцарські (табл. 2). Цю нижчу генотипову різноманітність у швейцарських популяціях можна пояснити історичними вузькими місцями (Zoller et al, 1999). Крім того, ми також виявили, що популяції острова Ванкувер, за винятком популяції CL, мали менший генотиповий різноманітність, ніж популяції материка. Це може бути пов'язано з просторовою ізоляцією цих популяцій (Walser et al., Неопубліковані дані). Цікаво, що кількість різних генотипів продемонструвала негативний зв’язок з місцевим населенням, що може свідчити про те, що щільніші популяції підтримують більшу кількість генотипів.
Крім того, наші дані вказують на значне дрібномасштабне клональне поширення в межах трьох швейцарських популяцій (Вальсер, у пресі). Різні просторові генетичні структури між популяціями на двох континентах можна віднести до щільності популяції та історії. Наприклад, популяції з Британської Колумбії трапляються в менш порушених лісових екосистемах порівняно зі швейцарськими популяціями, що, можливо, призвело до вищої місцевої щільності, перекриття поколінь та більшої кількості генотипів, навіть на невеликій території. Цікаво, що Гу та ін. (2001) встановили, що просторова закономірність L. pulmonaria у Фінляндії була більш контрольованою, ніж у пралісах. Хоча вони не досліджували просторову генетичну структуру, їх результати разом з нашими результатами свідчать про те, що історія популяцій може впливати на просторові закономірності всередині популяції.
висновки
Дякую
Дякуємо Тревору Говарду та Енді Маккіннону за розміщення, жваву дискусію та допомогу на місцях. Ми також вдячні Філу ЛеПейджу, Девіду Кузнеру та Трейс Лейс-Широк з Лісової служби Британської Колумбії за підтримку. Ми в боргу перед Сьюзен Е Хобі, двома рецензентами та редактором, за їх конструктивні коментарі до рукопису. Це дослідження фінансувалось Швейцарським національним науковим фондом (SNF 31-59241.99) і пов'язане з Програмою досліджень виживання рослин NCCR, PS6.