складу

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Значна різниця у філогенетичних складах між трьома ділянками свиней
  • Порівняння функціональної здатності мікробіома кишечника в тонкій кишці та сліпій кишці
  • Порівняння структури мікробної спільноти серед свиней з чітким вмістом жиру в різних положеннях кишечника
  • Порівняльна функціональна здатність кишкових мікробів між свинями високої та низької ваги
  • обговорення
  • Матеріали і методи
  • Збір просвітніх проб тварин і субпродуктів
  • Екстракція просвіту ДНК та аналіз послідовності генів 16S рРНК
  • Побудова файлів ДНК та бібліотек для метагеномного секвенування
  • Асамблея коротких читань
  • Прогнозування генів та функціональна класифікація
  • Аналіз філогенетичного складу на основі даних метагеномного секвенування
  • Порівняння функціональної здатності кишкових мікробів
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

реферат

У цьому дослідженні ми зосередилися на використанні секвенування генів 16S рРНК та високопродуктивного підходу до метагеномного секвенування для з’ясування структури мікробної спільноти та потенційної функціональної спроможності метагеноміки у товстій кишці, клубовій кишці та апендиксі у китайських свиней Laiwu, що демонструє сильний жир здатність зберігання. Ми порівняли мікробний склад та потенційну функціональну здатність мікробів між трьома кишковими ділянками та оцінили вплив кишкової мікробіоти на зберігання свиней.

результат

Значна різниця у філогенетичних складах між трьома ділянками свиней

Для характеристики філогенетичного складу бактеріальних спільнот на різних ділянках кишечника ми спочатку провели аналіз послідовності генів 16S рРНК та порівняли альфа-різноманітність мікробіоти між товстою кишкою, клубовою кишкою та сліпою кишкою. У сліпій кишці був значно вищий індекс Шеннона (враховуючи кількість видів та баланс видів), ніж тонка кишка та клубова кишка (P

Аналіз проводили за даними області 16S рРНК V4. Назви зразків кодуються відповідно до породи (Lw, порода Laiwu), місця відбору проб (Je, Jejunum; Il, Ileum; Ce, Cecum) та стану накопичення жиру (Ob, високий вміст жиру, Le, вага з низьким вмістом жиру). Наприклад, LwI10b являв собою зразок, взятий з клубової кишки свиней з високим вмістом жиру Laiwu. Зразки з однаковим арабським номером у назві зразка відбирали у тієї ж свині. A. Порівняння альфа-різноманітності на основі індексу різноманітності Шеннона, згрупованого за місцем відбору проб та станом зберігання жиру (середнє значення ± SEM). Порівняно з клубовою кишкою та тонкою кишкою, апендикс має значно вищу мікробну насиченість. ( B ) Незважений основний координатний аналіз UniFrac бактеріальним мікробіотом. Зразки тонкої кишки (клубової кишки та тонкої кишки) та апендикса демонструють чітке відокремлення ( C. ) Дерево скупчення Брей-Кертіса. Зразки з тієї ж тенденцією локалізації кишечника об'єднуються.

Повнорозмірне зображення

Потім ми вивчили зміни у філогенетичному різноманітті між усіма випробуваними зразками. За винятком зразка LwIlLe.5, який був об'єднаний у зразки сліпої кишки, всі інші зразки продемонстрували чітке агрегування між тонкою кишкою (тонка кишка і клубова кишка) та сліпою кишкою в незваженому головному координатному аналізі (PCoA) (рис. 1B). Подібним чином, хоча філогенетичний склад LwCeOb.4 із сліпої кишки був подібним до зразків клубової кишки, а зразок LwIlLe.5 із клубової кишки виявляв схожість із зразками сліпої кишки, більшість зразків демонстрували інший філогенетичний склад між тонкою кишкою та сліпою кишкою у Bray C 1С). Різне бета-різноманіття вищезазначених двох зразків повинно бути обумовлене жировим станом (див. Нижче). Однак ми не спостерігали жодної чіткої агрегації між зразками тонкої кишки та клубової кишки.

( A ) Мікробна композиція на рівні штаму. Зразки показані вздовж горизонтальної осі, а відносна кількість - вертикальною віссю. ( B ) Теплова карта, що показує 18 родів із значними відмінностями у відносному представленні між трьома кишковими ділянками. Карта карти має кольорове кодування на основі z-оцінки в рядку.

Повнорозмірне зображення

Дані метагеномного секвенування також використовувались для порівняння структури мікробних спільнот між тонкою кишкою, клубовою кишкою та сліпою кишкою. Для побудови бібліотек для метагеномного секвенування використано загалом 6 запасів просвітньої ДНК з трьох кишкових локацій свиней Лайву. Кожен сайт містив два набори ДНК, включаючи один від свиней з високим вмістом жиру, а інший від свиней з низьким вмістом жиру (методи). Ми отримали в середньому 11,43 Гб вихідних даних для кожної групи ДНК, коливаючись від 9,22 Гб до 14,29 Гб (Таблиця 1). Відфільтрувавши низьку якість та значення забруднення господаря, ми отримали від 3,53 Гб до 5,01 Гб нетто-даних для кожного зразка. Ми виконали de novo компіляцію всіх даних короткої послідовності за допомогою асемблера SOAPden (версія 1.06) 17. Кількість контигів шести зразків ДНК коливалася від 40 420 до 139 978 з довжиною контигмента> 500 bp (таблиця 1). Програма MetaGeneMark (MGM) була використана для прогнозування відкритої рамки зчитування (ORF) кожного контигу (див. Методи). Шість зразків містили в цілому 1056 020 ORF, які були довшими за 100 bp (Таблиця 1).

Стіл в натуральну величину

Потім ми порівняли структуру мікробної спільноти між трьома кишковими ділянками на основі даних метагеномного секвенування. У мікробіотиках усіх трьох відділів кишечника переважало бактеріальне царство, яке займало понад 90% від загальної кількості прочитаних коротких послідовностей. Мікробна композиція була досить схожа на композицію при аналізі послідовності гена 16S рРНК на рівні штаму (додаткова фігура S2). Аналіз метагеномних послідовностей покращив роздільну здатність філотипів від рівня роду до рівня виду. При значних порогах P 18, Faecalibacterium prausnitzii 19 та Butyrivibrio fibrisolvens 20 (рис. 3А та додаткова таблиця S2).

( A ) Теплова карта показує відносну кількість 21 виду бактерій, значно збагачених в тонку кишку, клубову кишку та сліпу кишку. ( B ) Теплова карта функціональних термінів CAZ, яка показала суттєво різне збагачення тонкої кишки, клубової кишки та сліпої кишки. GH: Глікозид-гідроаза, GT: Глікозилтрансфераза, PL: Полісахаридна ліаза, CE: вуглеводневі естерази, CBM: модуль зв'язування вуглеводнів. ( C. ) Теплова карта підсистем KEGG, значно збагачена товстою кишкою, клубовою кишкою та сліпою кишкою.

Повнорозмірне зображення

Порівняння функціональної здатності мікробіома кишечника в тонкій кишці та сліпій кишці

Порівняння структури мікробної спільноти серед свиней з чітким вмістом жиру в різних положеннях кишечника

Порівняльна функціональна здатність кишкових мікробів між свинями високої та низької ваги

( A - C. ) показують порівняння відносної кількості функціональних термінів CAZy між свинями з високим та низьким вмістом жиру в тодкій кишці, клубовій кишці та апендиксі. GH: Глікозид-гідроаза, GT: Глікозилтрансфераза, PL: Полісахаридна ліаза, CE: вуглеводневі естерази, CBM: модуль зв'язування вуглеводнів. ( D - F ) вказують порівняння відносної кількості підсистем KEGG між свинями свиней високого та низького рівня в тонкій кишці, клубовій кишці та додатку.

Повнорозмірне зображення

Анотація KEGG була використана для подальшого порівняння функціональної здатності мікробіому кишечника між свинями з низьким та високим вмістом жиру. У тодкій кишці гени, пов’язані з метаболізмом пірувату, метаболізмом пропаноату та метаболізмом цистеїну та метіоніну, значно збагачені метагеномом свиней з високим вмістом жиру (рис. 4D). Однак гени, пов’язані з метаболізмом піримідину, секреторною системою та біосинтезом фолієвої кислоти, мали більше свиней у свиней з низькою вагою. У клубовій кишці гени, пов’язані з деградацією глікану, метаболізмом піримідину, деградацією глікозаміноглікану та біосинтезом глікосфінголіпідів, були більш поширеними у свиней з низьким вмістом жиру (рис. 4Е), тоді як обробка та представлення антигенів, сигнальний шлях грипу А, МАРК та високий вміст ендокринної жиру свиней. У сліпій кишці сигнальний шлях адипоцитокінів, клітинний антиген та перетравлення та поглинання білка показали вищі збагачення свиней з низьким вмістом жиру. Однак двокомпонентна система, деградація бензоату та бактеріальний хемотаксис значно збагачені метагомами свиней із високим вмістом жиру (рис. 4F).

обговорення

Було проведено кілька досліджень кишкового мікробного складу свиней на основі секвенування генів 16S рРНК 26, 27, 28. Наскільки нам відомо, існує лише кілька звітів про аналіз метагеномного секвенування свиней, які можуть оцінити структуру мікробної спільноти на видовому рівні в різних місцях кишечника. У цьому дослідженні ми порівняли структуру мікробних спільнот у трьох ділянках кишечника, охарактеризували функціональну здатність мікробіома свині від переднього до заднього та вивчили потенційний зв’язок між кишковим мікробіомом та свинячим жиром, використовуючи високоефективне секвенування нового покоління. Наскільки нам відомо, це перший звіт про всебічний аналіз структури мікробної спільноти свиней тонкої кишки та оцінку видів кишкових бактерій, пов’язаних із свинячим жиром.

При аналізі KEGG система фосфотрансферази (PTS) значно збагатилася в тонкому кишечнику. PTS - це складна групова система транслокації, присутня у багатьох бактеріях. Він транспортує цукру (такі як маноза, глюкоза та маніт) до клітини та фосфорилює субстрат за допомогою фосфотрансферази під час транспортування. Відповідно до цього результату, функціональні анотації метагеном CAZγ також виявили, що мікробіом у тонкому кишечнику має тенденцію метаболізувати поживні речовини дрібних молекул, таких як моносахарид. Zoetendal та ін. 32 також припускав, що швидке засвоєння та бродіння простих вуглеводів (таких як глюкоза та мальтоза) сприяють підтримці мікробіоти в тонкому кишечнику. Більшість генів, пов'язаних з PTS-шляхом, були отримані з Clostridium в тонкому кишечнику. Цей результат узгоджувався з тим фактом, що 12 видів Clostridium збагатилися на тонусі та клубовій кишці. Відомо, що багато клостридії можуть перетравлювати сироватку та цукор з утворенням бутанолу, пропіонової кислоти, ефіру та гліцерину. Насправді, підсистеми метаболізму бутаноатів та жирних кислот були вищими в тонкій кишці та клубовій кишці (рис. 3С).

Свині з високим вмістом жиру мали значно нижчий рівень Prevotella spp. та Bacteroides spp. в клубовій кишці та апендиксі. Іварссон та ін. 42 повідомлялося, що кількість бактерій Prevotella - Porphyry у свиней, що виростають, позитивно корелювало з ферментаційною здатністю полісахаридів до коротколанцюгових жирних кислот (SCFA). Дослідження на мишах, які трансплантували мікробіоти калу людини від близнюків, які не страждають ожирінням, показало, що збільшення кишкового мікробіолу в кишечнику SCFA впливає на енергетичний баланс господаря, гальмує накопичення жиру в жировій тканині та сприяє підвищенню рівня лептину 43. Крім того, Bacteroides - Prevotella показали негативну кореляцію з розвитком жирової маси та запаленням у мишей із ожирінням, спричинених дієтою 44 .

З іншого боку, мікробний метаболізм та зондування поживних речовин (метаболічна реакція) також повинні бути пов’язані із свинячим жиром. У тодкій кишці свині з високим вмістом жиру збагачувались на кілька підсистем, пов’язаних з метаболізмом, напр. Метаболізм цистеїну та метіоніну. У сліпій кишці у свиней з високим вмістом жиру збагачувались шляхи KEGG, які зв’язуються з рухливістю клітин (складання джгутикових) та мембранним транспортом (двокомпонентна система та транспортери). Також повідомляється, що ці категорії KEGG збагачуються головним чином дистальним мікробіомом товстої кишки мишей із ожирінням у мишей та людей 5, 8, 45 та дієтою з високим вмістом жиру, індукованою мишами 39. Двокомпонентна система бере участь у механізмі передачі сигналу та бактеріальному хемотаксисі 46, 47 і може використовуватися як метаболічний реакційний центр, поєднуючи зондування поживних речовин з динамічною регуляцією метаболізму моносахаридів 48 .

На закінчення ми спостерігали чітку структуру мікробних спільнот між тонкою кишкою та апендиксом та виявили десятки видів бактерій, які продемонстрували значні відмінності у відносній чисельності на кожному ділянці кишечника. Ми виявили чітку функціональну здатність мікробіома між тонкою кишкою та апендиксом. Ми припустили, що потенційні патогени (наприклад, Escherichia spp.), Запальні процеси та мікробний метаболізм та чутливість поживних речовин повинні бути залучені до високого вмісту жиру у свинях. Крім того, більш високий рівень бактерій і Prevotelly може стримувати розвиток жиру та запалення у свиней з низьким вмістом жиру. Ці результати можуть дати цікаве уявлення про складність шлунково-кишкового мікробного співтовариства свиней і можуть допомогти нам краще зрозуміти вплив мікробіоти кишечника на ознаки свинарства.

Матеріали і методи

Збір просвітніх проб тварин і субпродуктів

Екстракція просвіту ДНК та аналіз послідовності генів 16S рРНК

Побудова файлів ДНК та бібліотек для метагеномного секвенування

Два набори ДНК для кожної тонкої кишки, клубової кишки та сліпої кишки були побудовані з однаковою кількістю просвітньої ДНК від кожної тварини та забезпечували метагеномне секвенування, включаючи один набір ДНК від 4 свиней з високим вмістом жиру та другий набір ДНК від 4 з низьким вмістом жиру товсті свині. Бібліотеки ДНК для метагеномного секвенування були побудовані відповідно до інструкцій виробника (Illumina, США). Кожен набір ДНК був побудований як бібліотека парних кінців із розміром вставки

350 пар основ. Ми використовували той самий протокол, що описаний Qin et al. 56 для виконання генерації та послідовності кластерів на платформі Hiseq 2000 (Іллуміна, США). Дані метагеномної послідовності зберігалися в архіві короткого читання NCBI (номери доступу в Додатковій таблиці S6).

Асамблея коротких читань

Спочатку ми обробили вихідні дані для фільтрації низькоякісних та забруднених хостом послідовностей на основі внутрішньої процедури: I. Видалення записів зчитування, що містять більше трьох невідомих баз або постійних низькоякісних баз; II. Забруднення та дублювання адаптера були усічені; III. Показання, зіставлені з еталонною геномною послідовністю свиней, були видалені з подальшого аналізу. А потім складання de novo високоякісних коротких показань було виконано асемблером SOAP de novo (v1.06) 17. Неперервні послідовності з однозначними переходами вважалися контигами.

Прогнозування генів та функціональна класифікація

MetaGeneMark (MGM, v2.10) був використаний для прогнозування повного діапазону ORF з контигів кожного зразка 57. Ми використовували програму cd-hit (v4.6.1), щоб виключити зайві гени з усіх передбачуваних ORF 58. Пара генів упорядкованої довжини, що охоплює більше 90% коротшого гена та> 95% ідентичності, були згруповані разом. А потім гени, що поділяли групу, об’єдналися. Злита група була представлена ​​найдовшим геном. Інших членів групи відпустили. Набір непотрібних генів був побудований шляхом видалення надмірності. Нарешті, непотрібні гени порівнювали з білковими послідовностями баз даних KEGG 22 (v59) та CAZy 21 (ферменти, активні у вуглеводах), використовуючи інструмент BLAST (v2.2.21) з e-значенням ≤ 1 × 10 -5 і пороговим порогом ≥ 40%. Анотовані гени були включені в шляхи KEGG. Щоб простежити гени до мікробів, білкові послідовності генів порівнювали з випущеною базою даних про бактеріальні референтні білки, використовуючи інструмент blastp з e-значенням ≤ 1 x 10-40. Вирівнювання з найвищим балом було збережено для подальшого аналізу.

Аналіз філогенетичного складу на основі даних метагеномного секвенування

Завантаживши відомі бактерії, гриби, віруси та архебактерії, було створено каталог зайвих референтних генів свиней. Еквалайзер SOAP (v2.21) був використаний для зіставлення високоякісних послідовностей зчитування з мікробними спільнотами проти еталонного каталогу генів 59. Відповідно до теореми про центральну межу, середні значення відносної кількості мікробів у досліджуваних зразках, з яких були взяті зразки з популяції, відповідають нормальному розподілу. ANOVA був використаний для порівняння філогенетичного складу між трьома кишковими ділянками. Точний тест Фішера був використаний для порівняння двох зразків свиней високої та низької ваги. Мікроби з відносним коефіцієнтом чисельності 60. Всі тести проводились за допомогою програмного забезпечення STAMP 53 .

Порівняння функціональної здатності кишкових мікробів

Для порівняння функціональної здатності мікробіомів кишечника, кількість анотованих генів нормалізували наступним чином: (кількість зчитувань, зіставлених з кожним геном/загальна кількість чистих зчитувань) * 100000. Відносна кількість ряду кожного підкласу членів сімейств CAZy та шляхів KEGG була розрахована шляхом підсумовування чисельності цих генів, котрі були анотовані до функціональної підсистеми. Порівняння профілів функціональної здатності свиней із високою та низькою вгодованістю проводили за точним тестом Фішера. Тест ANOVA був використаний для порівняння функціональної здатності мікробіомів між трьома місцями кишечника. Z-оцінки були розраховані для побудови теплових карт для відображення відносного вмісту підсистем KEGG та CAZy у кожній вибірці. Для попарних порівнянь використовували пост-хок-тест Тукі-Крамера. FDR Story був використаний для виправлення кількох порівнянь 60. Всі тести проводились за допомогою програмного забезпечення STAMP 53 .

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Ян, Х. та ін. Розкриття складу структури мікробної спільноти та метагеноміки серед трьох локалізацій кишечника у свиней з чітко вираженою вгодованістю. Наук. Респ. 6, 27427; doi: 10.1038/srep27427 (2016).

Додаткова інформація

Документи Word

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.