S KoA. a, R-COOH + ATP + CoA R C

зовнішніх

ДИСЕРТАЦІЯ УНІВЕРСИТЕТСЬКОГО ДОКТОРА (PhD) Розробка, дослідження in vitro та in vivo оральних та зовнішніх лікарських форм, що містять Silybum marianum Доктор Siposné Д-р Fehér Pálma Керівник: Д-р Miklós Vecsernyés УНІВЕРСИТЕТ ДЕМБРЕНТУ 2017 ЛІКАР ФАРМАЦЕВТИЧНИХ НАУК

7. Бібліографія. 94 7.1. Література, яка використовувалася для підготовки дисертації. 94 7.2. Перевірений перелік публікацій, на яких базується дисертація. 113 7.3. Список малюнків. 117 7.4. Список таблиць. 120 8/A Ключові слова. 121 8/Б Ключові слова. 121 9. Подяки. 122 Додаток 10. 123 10.1. Допомога. 123 10.2. Доповіді, на яких базується дисертація. 124 5

Скорочення ГПД Американська асоціація фармацевтичних вчених ALT АЛТ АСТ аспартат амінотрансферази модифікованому середовищі BCS біофармацевтичної системи класифікації BHT бутилгідрокситолуол CAT каталази CCl4 чотирихлористий вуглець ЦБС Клітинні лінії Послуги DLS динамічного розсіювання світла DMEM Дульбекко сек Орлине сек DMSO EC диметилового етілендіаміна-Tetraaceticacid FBS фетальний Сироватка великої рогатої худоби FDA Управління харчовими продуктами та ліками GC/MS Газова хроматографія - Масова спектроскопія GPx Глутатион пероксидаза GR Глутатіон редуктаза GSH глутатіон GSSG Глутатіон дисульфід HaCaT Температура L2a Шкіра дорослої людини Кератиноцити, низький баланс Ca Баланс HO Гем Оксигеназа MS-MS Висока продуктивність MS-РЕХ -тандемна мас-спектроскопія ІЛ Інтерлейкін ІПМ Ізопропілміристат МДА Малондіальдегід МТТ 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолій бромід NADH леотид 6

NADPH Нікотинамід аденин динуклеотид фосфат NF-κB Ядерний фактор каппа-підсилювач легких ланцюгів активованих В-клітин NMF Природний зволожуючий фактор Nrf2 Ядерний фактор еритоїдний 2-пов'язаний фактор 2 PBS Фосфатно-сольовий сольовий розчин PS 750 Сахароза пальміталевий ROS Реактивний реактивний кисневий тип Емульгуюча система доставки ліків SLN Тверді ліпідні наночастинки SMEDDS Самомікро-емульгуюча система доставки ліків SOD Супероксиддисмутаза SP 50 Сахароза стеари 50% моноестери SP 70 Сахароза стеарат 70% моноестери TBA Тіобарбітурова кислота TC Транскутол TNFα Пухлина Фактор Фармакологічна хвороба ООН Некроз Фармакологічні захворювання 7

Малюнок 2. Конспекти експериментальної роботи 11

2. Огляд літератури 2.1. Silybum marianum Silybum marianum є найбільш часто використовуваною рослиною для профілактики та лікування захворювань печінки (рисунок 3) (Pepping 1999, Shaker et al. 2010). Звіробій успішно застосовується в народній медицині протягом століть. Рослина належить до племені закритих культур і до сімейства гніздових суцвіть (Asteraceae), походить з Південно-Західної Азії, є рослиною, вирощеною в Угорщині (Vargas-Mendoza et al. 2014). Малюнок 3. Silybum marianum/джерело: http://evgyogynovenye.hu/2013_mariatovis/ 2.2. Хімічний склад насіння Silybum marianum Коричневий плід звіробою (Silybi mariani fructus) використовується в медицині. Він також є офіційним в Угорській фармакопеї як Silybi mariani extractum siccum rafinatum et normum. Препарат являє собою очищений, стандартизований екстракт плодів, вміст його силімарину становить 30-65%, він є сировиною багатьох лікарських засобів, лікарських засобів та дієтичних добавок в Угорщині (Ph. Hg.VIII.). Урожайність становить приблизно Він довжиною 6 мм і містить найбільшу кількість жирної олії (15-30%) і білка (20-30%). Однак з фармацевтичної точки зору суміш сполук у фруктах, яку в сукупності називають силімарином, є хімічно флавонолігнановим комплексом. Основна діюча речовина ядра - 12

концентрований силімарин містить найбільшу кількість (близько 50%) силібіну (псевдонім силібінін), але також значну кількість силікристіну, сілідіаніну та ізосилібініну (рис. 4). Під час екстракції можна виділити дві фази - твердий порошок і рідку маслянисту частину від сучасного насіння колючки, яке є зрілим плодом рослини. Компонент порошку силімарину, який використовувався в наших експериментах, був описаний Kuki та співавт. (Kuki et al. 2012), що характеризується мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС/МС) у поєднанні з високоефективною рідинною хроматографією. На додаток до основних біоактивних флавоноїдних компонентів, таких як силикристин А і В, силідіанін, силібін А і В, ізосилібін А і В, також були виявлені і частково розділені три додаткові компоненти; імовірно два стереоізомери силібіну та один стереоізомер ізосілібіну (Kuki et al. 2012). 13

Малюнок 4. Хімічна структура основних компонентів силімарину (Kuki et al. 2012) Силімаринова олія є побічним продуктом вилучення насіння розторопші. Олія містить незамінні жирні кислоти, фосфоліпіди, стерини та відносно велику кількість вітаміну Е (Hadolin et al. 2001). За допомогою газової хроматографії з оливи силімарину визначали такі компоненти жирних кислот: лінолева кислота (39%), олеїнова кислота (36,7%), пальмітинова кислота (10,1%), стеаринова кислота (6,8%), ліноленова кислота (3,6%), арахідова кислоти (2,9%) та бегенової кислоти (0,57%) (Fathi-Achachlouei et al. 2016). 14

має погану розчинність у воді (0,04 мг/мл). Його розчинність в інших розчинниках така: транскутол (350,1 мг/мл), етанол (225,2 мг/мл), полісорбат 20 (131,3 мг/мл), гліцерилмоноолеат (33,2 мг/мл) (Javed et al. 2011). Силімарин класифікується відповідно до системи класифікації біофармацевтичних препаратів у Додатку IV. класу (погана розчинність, погана проникність), низька біодоступність, що часто гальмує використання, незважаючи на сприятливі терапевтичні можливості. В останні роки ряд досліджень було зосереджено на підвищенні біодоступності силімарину, зміні розчинності, проникності, метаболізму та виведенні флавоноїдного комплексу. причини низької біодоступності силімарину високий метаболізм фази II погана проникність у клітинах епітелію тонкої кишки погана розчинність у воді Рисунок 5. Причини низької біодоступності силімарину (Javed et al. 2011) 17

2.3.4. Підвищення біодоступності силімарину Хоча матеріал моєї дисертації не включає використання порошку силімарину у пероральній лікарській формі, я хотів надати огляд літератури про те, які методи використовувались для підвищення його біодоступності дотепер. У літературі можна знайти кілька рішень для кращої біодоступності порошку силімарину. Вагомі дані демонструють, що силімарин демонструє набагато сприятливіші фармакокінетичні параметри для добре всмоктуваних похідних (наприклад, солей, глікозидів) та у відповідній лікарській формі, такі як вкладена ліпосома, тверда дисперсія, наносистема тощо. (Малюнок 6). У наступному розділі я коротко оглядаю події, які намагалися вирішити труднощі перорального введення силімарину. підвищують біодоступність комплексу силімарину з водорозчинними похідними, наприклад солі, глікозиди розробка нових лікарських форм Рисунок 6. Підвищення біодоступності силімарину 2.3.4.1. Утворення комплексованого силімарину Комплексація з фосфатидилхоліном Біодоступність екстракту звіробою може бути збільшена в поєднанні з комплексоутворювачем. Силібін у поєднанні з фосфатидилхоліном збільшує пероральний прийом

Малюнок 7. Розташування мікроемульсійної системи в потрійній системі (джерело: Уйгелі З. Дисертація, 2014) 2.3.7. Допоміжні речовини, що використовуються у рецептурі S (M) EDDS. Нафтовий компонент сприяє самоемульгуванню та може сприяти абсорбції активного інгредієнта із шлунково-кишкового тракту. У рецептурі в основному використовуються натуральні олії та довголанцюгові тригліцериди (Gowri et al. 2012). Масляний компонент сприяє кишковому лімфатичному транспорту препарату (Dixit et al. 2010). Природа та частка цього компонента найбільше визначаються самоемульгуючими системами. Однак також було показано, що сама лікарська форма може збільшити абсорбцію та терапевтичний ефект масляного компонента. (Zidan et al. 2007, Gang and Yan 2011). Вибір неіоногенних сурфактантів є переважними, оскільки вони викликають незначні, оборотні зміни проникності стінок кишечника. Концентрація цього компонента зазвичай становить: 30-60% у лікарській формі (Gowri et al. 2012). Завдяки своїм амфіфільним властивостям вони солюбілізують гідрофобні компоненти, запобігають деградації діючої речовини та досягають тривалого ефекту. Характер і концентрація ПАР визначають розмір крапель після потрапляння у водне середовище. 26

Третя група допоміжних речовин - це котензиди. Їх метою є розчинення основних гідрофільних ПАР або гідрофобних речовин у ліпідній фазі. Наприклад, діетиленгліколь моноетиловий ефір, поліетиленгліколь. Збільшення концентрації котензиду сприяє вивільненню препарату з лікарської форми (Gowri et al. 2012). 27

3. Дослідження консистенції кремів за допомогою аналізатора текстур та дослідження вивільнення активної речовини in vitro за допомогою дифузійної клітини Франца. 4. Дослідження цитотоксичності in vitro кремів на клітинних лініях HeLa та HaCaT. 5. Визначення значень TEWL в тесті подразнення in vivo на моделі морської свинки. 6. Дослідження антиоксидантної дії крему in vitro на клітинну лінію HaCaT та in vivo у морських свинок до та після опромінення UVB. 7. Визначення активності ферменту HO-1 з тканини шкіри морської свинки під час попередньої та подальшої обробки кремом проти УФ-випромінювання. 44

Групова попередня обробка ізотонічного CCl4 I.P. Евтаназія та введення розчину натрію (7 днів) (7 днів ін’єкція на 8 день (1,0 мл/кг) вивих шийки на 9 день) Група 1 - + - + Група 2 - + + + Група 3 SMEDDS po - + + 500 мг/кг Група 4 СМЕДДС п.о. - + + 1000 мг/кг Група 5 СМЕДДС п.о. - _ + 500 мг/кг Група 6 СМЕДДС п.о. 1000 мг/кг - - + Таблиця 3: Протокол лікування експериментів SMEDDS, що містять олію силімарину в дослідженнях in vivo на мишах 3.4.5. Визначення значень ферментів печінки у мишей Кров, зібрану до вивиху шийки матки, поміщали в гепаринову пробірку та центрифугували (15 хв, 2000 г) для отримання плазми. Зразки плазми негайно аналізували на активність аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST) шляхом спектрофотометричного вимірювання за допомогою набору (Roche, Франція), як описано виробником. 3.4.6. Приготування білкового екстракту печінки Для приготування загального білкового екстракту 0,1 г тканини печінки суспендували в холодному 0,1 М трис-HCl-буфері (pH 7,4), що містить 5 мМ ЕДТА та свіжододаний коктейль-інгібітор протеази. Потім у кульовій млині (тип MM 301, Retsch GmbH та 48

(Спектрофлуорометр FP-6300 JASCO). Концентрацію малонового диальдегіду визначали за допомогою стандарту 1,1,3,3-тетраметоксипропану. Результати виражаються в нмоль МДА/мг білка. 3.5. Розробка та випробування крему, що містить порошок силімарину 3.5.1. Формування кремів, що містять силімариновий порошок Для приготування кремів використовували різні емульгатори, такі як полісорбат 60 (P60), кремофор A6 та A25 (C) у співвідношенні 1: 1 та різні типи ефіру цукру (SP50, SP70, PS750). Під час приготування кремів типу o/v, нагрівання (60 ºC) та змішування цетилстеарилового спирту, стеаринової кислоти та ізопропілміристату (IPM) утворювали масляну фазу. Водна фаза містила пропіленгліколь, емульгатор і очищену воду, яку нагрівали до тієї ж температури (60 ºC) і перемішували для олійної фази. Після гомогенізації та охолодження (25 ºC) до кремів додавали Ніпагін М та діючу речовину, порошок силімарину. 5% порошку додавали до кремів або у вигляді суспензії (композиція I-V), або у розчиненій формі (композиція VI-X). Для розчинених композицій порошок силімарину попередньо розчиняли у Transcutol HP (TC) (Таблиця 4). 51

Суспендовані розчинені інгредієнти (g) I. II. III. ARC. V. VI. VII. VIII. IX. X. Силімарин 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 порошок Транскутол - - - - - 14,2 14,2 14,2 14,2 14,2 Полісорбат 3 - - - - 3 - - - - 60 Кремофор - 3 - - - - 3 - - - A6: A25 (1: 1) Ефір цукру - - 3 - - - - 3 - - SP50 Ефір цукру - - - 3 - - - - 3 - SP70 Ефір цукру - - - - 3 - - - - 3 PS750 Цетилстеарил 4,6 спирт Стеариновий кислота 10 Пропіленгліколь 5 Ізопропілміристат 5 Розчин консерванту 1 Очищена вода дає 100 Таблиця 4. Склад одноразових емульсійних кремів, що містять порошок силімарину 52

відмінності p P60> SP50> PS750 = C. Як на клітинних лініях HeLa, так і на HaCaT найкраще переносився крем, що містить емульгатор SP70, з життєздатністю клітин 68,45% ± 0,6 на HeLa та 63,7 ± 0,6% на клітинах HaCaT. Результати життєздатності клітин порівнювали з позитивним контролем TritonX-100. 72

Малюнок 17. Тест МТТ є результатом життєздатності клітин на клітинах HaCat та HeLa після обробки кремами, що містять силімарин (I-X). Кожне значення показує середнє значення ± S.D, n = 10. Дані оцінювались за допомогою методу Anova для кількох пасажирів, а міжгрупові порівняння проводились за допомогою перської кореляції. На малюнку зірочкою * (стор