Предмети

Резюме

Вступ

Як і клітини ссавців, заарештовані в місці рестрикції G2, ооцити Xenopus (стадія VI) природним чином зупиняються на межі G2/M першого мейотичного поділу, а відновлення циклів мейотичних клітин вимагає стимуляції та активації мітогеном каскаду MAPK. У фізіологічних умовах стимуляція прогестероном повністю вирощених ооцитів Xenopus вивільняє арешт фази G2 шляхом активації мітотичного Cdk 25, і процес включає активацію каскаду MAPK новосинтезованою MOS-протеїнкіназою, яка, в свою чергу, колись активує MEK. 26, 27, 28, 29 Через подібність у зв'язуванні каскаду MAPK з регуляцією переходу G2/M, окресліть молекулярний механізм, за допомогою якого каскад MAPK сприяє переходу G2/M в стимульованих ооцитах Xenopus з прогестероном. Роман механічного розуміння того, як цей каскад позитивно регулює перехід G2/M в циклах соматичних клітин.

У цьому дослідженні ми характеризуємо роль RSK у фосфорилюванні та активації людських ізоформ Cdc25 (hCdc25) у клітинних лініях людини. Наші результати свідчать про те, що RSK відіграє важливу роль у фосфорилюванні та активації hCdc25A та hCdc25B у процесі переходу G2/M.

Результати

Рекомбінантні RSK фосфорилюють ізоформи A, B та C hCdc25 у збереженому мотиві поблизу каталітичного домену

Серед численних потенційних місць фосфорилювання RSK при xCdc25C, RSK2 переважно фосфорилює S317, T318 та/або S319 на мотиві 313 KRRRSTS 319. 36 Парне вирівнювання hCdc25A, hCdc25B та hCdc25C з xCdc25C показало, що сайти фосфорилювання RSK2 на xCdc25C розташовані в захищеній області поблизу каталітичного домену (рис. 1а). У межах цієї збереженої області три ізоформи hCdc25 містять ланцюг основних залишків, які вирівнюються з ланцюгом основних залишків у xCdc25C. Слідом за основним ланцюгом залишків є два залишки Ser у hCdc25A (S293 та S295), залишок Ser та залишок Thr у hCdc25B (S353 та T355) та залишок Ser у hCdc25C (S247). Ці залишки Ser/Thr вирівнюються з місцями фосфорилювання RSK2, визначеними в xCdc25C (рис. 1b). Збереження послідовності дозволяє припустити, що RSK фосфорилює безліч ізоформ hCdc25 у цьому збереженому мотиві.

активуючи

Повнорозмірне зображення

Щоб перевірити цю можливість, ми спочатку інкубували порівняні кількості мічених GST hCdc25A, hCdc25B або hCdc25C (1-2 мкг) з конститутивно активним мишачим RSK (CA-RSK) протягом 30 хвилин у присутності γ- 32 P-ATP . GST-xCdc25C використовували як позитивний контроль. Як показано на малюнку 1c, CA-RSK каталізував подібні або вищі рівні включення 32 P у GST-hCdc25A, GST-hCdc25B та GST-hCdc25C порівняно з позитивним контролем. Потім ми мутували Ser293 та Ser295 у hCdc25A до Ala293/Ala295 (2А), Ser353 та Thr355 у hCdc25B до Ala353/Val355 (AV) та Ser247 у hCdc25C до Ala247 (1A) та визначали вплив на CA-RSK-каталіз - фосфізований. Як показано на малюнку 1d, ці мутації значно зменшили опосередковане CA-RSK фосфорилювання ізоформ hCdc25. Разом ці результати демонструють, що очищений RSK здатний фосфорилювати збережений мотив у всіх трьох ізоформах hCdc25.

Рекомбінантний RSK та ендогенний RSK в екстрактах яєць Xenopus фосфорилюють усі передбачувані сайти RSK в ізоформах hCdc25

CA-RSK фосфорилює всі передбачувані сайти RSK в ізоформах hCdc25. Іммобілізовані білки GST-hCdc25 обробляли фальшиво або фосфорилювали CA-RSK. Білки, елюйовані з промитих гранул, імуноблотували кожним із зазначених фосфоспецифічних антитіл після фарбування Ponceau S (Ponc). Контекст послідовності сайту фосфорилювання, розпізнаний кожним з фосфоспецифічних антитіл, вказаний нижче імуноблотінгом. ( до - c ) Фосфорилювання дикого типу (WT) та S293A-S295A (2A) мутантної форми GST-Cdc25A. ( d Y і ) Фосфорилювання мутантної форми (AV) WT та S353A-T355V GST-Cdc25B. ( F ) Фосфорилювання мутантної форми GST-Cdc25C WT та S247A (1A).

Повнорозмірне зображення

Сайти RSK в hCdc25A та hCdc25B переважно фосфорилюються в мітотичних клітинах

Для характеристики RSK-опосередкованого фосфорилювання Cdc25 у клітинах ссавців було вперше визначено, чи є фосфорилювання місць RSK в ізоформах hCdc25 явищем, пов’язаним з фазою M. метастатичні) зростали асинхронно (~ 5% клітин при мітозі) або були синхронізовані при мітозі блокадою тимідину з подальшим блокуванням нокодазолу (> 80% клітин при мітозі). Після того, як денатуровані екстракти випадкових (R) та мітохондлічно синхронізованих (М) клітин були біохімічно перевірені імуноблоттингом з мітотичним фосфопротеїновим моноклональним антитілом MPM-2 (рис. 3а та b), фосфорилювання hCdc25 в місцях RSK з імуноблотом. фосфоспецифічні антитіла. Слід пам’ятати, що клітини HEK293 експресували всі три ізоформи hCdc25, тоді як клітини PC-3mm2 виражали лише виявлені рівні hCdc25A та hCdc25B (дані не наведені).

Сайти RSK в hCdc25A та hCdc25B переважно фосфорилюються в мітотичних клітинах. Білкові екстракти з клітин HEK293 R і M або клітин PC-3mm2 імуноблотували MPM-2 або антиактиновим антитілом ( a і b ), з антитілом проти hCdc25A або антитілом A-pS293 ( c і d ), або з антитілом проти hCdc25B або антитілом B-pS353 ( і Y F ). Стрілки позначають білки в повний зріст, а зірочки - витіснений hCdc25A.

Повнорозмірне зображення

Для hCdc25A фосфорилювання S293 було легко виявити лише в екстрактах М-клітин (малюнки 3c та d). На відміну від цього, рівень білка hCdc25A був подібним між екстрактами R та M клітин PC-3mm2. Хоча рівень білка hCdc25A був у 2-3 рази вищим у M, ніж у екстрактах R з клітин HEK293, ця різниця не могла пояснити приблизно 10-кратну різницю в рівні фосфорильованого hCdc25A S293. Для hCdc25B фосфорилювання S353 також було легко виявити лише в екстрактах клітин М. У цьому випадку рівень білка hCdc25B був однаковим між екстрактами клітин R та M для обох клітинних ліній (рис. 3e та f). Для hCdc25C фосфорилювання S247 було виявлено на прикордонних рівнях як у R, так і в M екстрактах клітин HEK293, незважаючи на присутність легко виявлених рівнів білка hCdc25C (дані не наведені). Ці результати вказують на те, що сайти RSK в hCdc25A і hCdc25B, але не в hCdc25C, переважно фосфорилюються в мітотичних клітинах.

Для подальшого вивчення цієї можливості ми інкубували GST-hCdc25A, GST-hCdc25B або GST-hCdc25C з різними розведеннями неденатурованих мітотичних екстрактів (ЕМ) протягом 30 хвилин і визначали фосфорилювання сайту RSK шляхом імуноблотування фосфоспецифічними антитілами (Додаткова фігура S2). Як для клітин HEK293, так і для ПК-3мм2, навіть GST-hCdc25A та GST-hCdc25B легко розбавляють 1: 64 ME на сайтах RSK. На противагу цьому, лише нерозбавлена ​​ЕМ з клітин HEK293 фосфорилювалась при S247 в GST-hCdc25C, і в S247 не виявлено фосфорилювання GST-hCdc25C з нерозведеною ЕМ з клітин PC-3mm2. Ці результати підтверджують переважне фосфорилювання сайтів RSK в hCdc25A та hCdc25B в мітотичних клітинах.

Фосфорилювання ділянок RSK на hCdc25A та hCdc25B збільшує їх активність, що викликає М-фазу

Щоб визначити функціональний вплив RSK-опосередкованого фосфорилювання hCdc25A та hCdc25B, ми ввели дикий тип та RSK-мутантні форми мічених мік hCdc25A або hCdc25B та порівняли їх здатність індукувати дозрівання ооцитів Xenopus. 32, 41, 42 Для myc-hCdc25A фосфодефективний мутант викликав дозрівання ооцитів mat50% з затримкою на 1 год порівняно з молекулою дикого типу (додатковий малюнок S3A). На відміну від цього, фосфоміметичний мутант викликав дозрівання ооцитів зі швидкістю, подібною до швидкості молекули дикого типу (додатковий малюнок S3B). Для myc-hCdc25B білок дикого типу індукував дозрівання 50% ооцитів mat50 через 4 години, тоді як фосфодефективний мутант - 50% дозрівання ооцитів через 8 годин (Додаткова фігура S3C). Знову ж таки, фосфоміметичний мутант діяв подібно до білка дикого типу (додаткова фігура S3D). Ці результати демонструють, що фосфорилювання сайтів RSK в hCdc25A та hCdc25B збільшує їх індукуючу активність фази M.

Повнорозмірне зображення

RSK є однією з основних кіназ в лізатах мітотичних клітин, які фосфорилюють сайти RSK на hCdc25A та hCdc25B

Раніше було показано, що авроракіназа А фосфорилює hCdc25B S353 у центросомах на початку мітозу. 44,45 Інші білкові кінази сімейства AGC у мітотичних клітинах можуть також фосфорилювати сайти RSK в ізоформах hCdc25 завдяки подібним сайтам акцепторів фосфорилювання. 46, 47 Для характеристики вкладу RSK у мітотичне фосфорилювання hCdc25A та hCdc25B на сайтах RSK ми фосфорилювали GST-hCdc25A та GST-hCdc25B з екстрактами M (ME) клітин HEK293 або PC-3mm2 за наявності або відсутності інгібітор RSK2 BI-D1870 або SL0101 та імуноблотовані субстрати з фосфоспецифічними антитілами; Фосфорилювання тих самих субстратів з Xenopus MEE послужило позитивним контролем.

У 1: 30 розведених ME з клітин HEK293 2 мкМ BI-D1870 або 40 мкМ SL0101 спричинили 50% зниження фосфорилювання GST-hCdc25A у S293 (рис. 5а та b) та GST-hCdc25B при S353 (рис. 5c та d). Подібні результати були отримані, коли фосфорилювання проводили з ME, розведеним 1: 60 з клітин PC-3mm2, або XEEPUS MEE, розведеним 1: 20 (дані не наведені). Однак інгібування не спостерігалось, коли фосфорилювання проводили з нерозведеним ME або MEE (дані не наведені). Ці результати вказують на те, що RSK є однією з основних кіназ в лізатах мітотичних та мейотичних клітин, які фосфорилюють сайти RSK у hCdc25A та hCdc25B.

Інгібітори RSK частково інгібують фосфорилювання сайтів RSK на hCdc25A та hCdc25B в лізатах мітотичних клітин. Іммобілізований GST-hCdc25A ( a і b ) та GST-hCdc25B ( c і d ) фосфорилювали з розведеним 1: 30 ME з клітин HEK293 у присутності або відсутності зазначених концентрацій BI-D1870 (a та c) або SL0101 ( byd ) при кімнатній температурі протягом 30 хв. Білки, елюйовані з промитих намистин, імуноблотували зазначеними фосфоспецифічними антитілами.

Повнорозмірне зображення

RSK-опосередковане фосфорилювання hCdc25 відіграє позитивну роль у переході G2/M

Інгібування активності RSK інгібіторами RSK інгібує перехід G2/M (( a і b ) Клітини HEK293, звільнені з одного тимідинового блоку, культивували у присутності одного лише ногодазолу (NC) або NC плюс BI-D1870 ( до ), або SL0101 ( b ) протягом зазначених годин, а витягнуті білки імуноблотували. MPM-2 після фарбування за допомогою Ponceau S (Ponc) (верхні панелі) або імуноблотингу антитілами до hCdc25A та A-pS293 (нижні панелі). Стрілки вказують положення hCdc25A, а зірочки - перехресно реагуючі поліпептиди. ( c і d ) Клітини ПК-3мм2, вивільнені з одного тимідинового блоку, обробляли, як описано на малюнках 6а та b.

Повнорозмірне зображення

Відомо, що РСК має різноманітні біологічні функції. Щоб визначити, чи сприяння активації Cdc25 є принаймні одним із основних механізмів, за допомогою яких RSK сприяє переходу G2/M, ми ектопічно виразили дефектні або міметичні мутантні форми FLAG-hCdc25B дикого типу або RSK у клітинах фази HEK293T. S та порівняли їх здатність протидіяти інгібуючому ефекту BI-D1870 на подальший перехід G2/M. Оскільки нефосфорильований Cdc25B має базовий рівень фосфатазної активності, очікувалося, що всі три форми FLAG-hCdc25B мали певні врятувальні ефекти. Однак якщо сприяння активації Cdc25 є важливим механізмом, за допомогою якого RSK сприяє переходу G2/M, фосфоміметична форма FLAG-hCdc25B повинна бути більш потужною, ніж інші дві форми молекули, щоб врятувати інгібуючий ефект BI-D1870.

Ми спостерігали входження мітозу через h 7 год після вивільнення арешту S фази в контрольних клітинах. Як показано на малюнку 7а, ~ 50% нетрансфікованих клітин вступили в мітоз без лікування BI-D1870, тоді як

Фосфоміметична мутантна форма hCdc25B ефективніше рятує інгібуючий ефект BI-D1870 на перехід G2/M. ( до ) Експоненціально зростаючі клітини HEK293T обробляли тимідином протягом приблизно 12 годин, а потім трансфікували вектором експресії для дикого типу (WT) або фосфодефективного сайту RSK або фосфоміметичної (2D) мутантної форми FLAG-hCdc25B або порожньої батьківський вектор (V). Після подальшого культивування трансфікованих клітин протягом приблизно 6 год у постійній присутності тимідину всі клітини перемикали на живильне середовище, доповнене нокодазолом (NC) плюс BI-D1870 або DMSO (диметилсульфоксид). Приблизно через 7 год після зміни середовища три поля випадково відібраних клітин були сфотографовані під фазово-контрастним мікроскопом, а відсоток клітин, що демонструють круглу мітотичну морфологію, визначали вручну з отриманих зображень. Помилки вказують на sd ( b ) Імуноблоти клітинних лізатів з анти-FLAG та антиактиновими антитілами. ( c ) Репрезентативні фазово-контрастні мікроскопічні зображення. Стрілки вказують на клітини з круглою мітотичною морфологією.

Повнорозмірне зображення

Один з ключових сайтів активації в RSK переважно фосфорилюється в мітотичних клітинах.

Один із сайтів активації в RSK переважно фосфорилюється в мітотичних клітинах. ( до - c ) Денатуровані екстракти R та M клітин HEK293 імуноблотували MPM-2 після фарбування Понсо S (Ponc) ( до ), або імуноблоттинг антитілами проти RSK1 та анти RSK2, або антифосфо-S227 та анти-Фосфо-Т359 - антитіла S363 ( b ). М екстракти імунопреципітували антитілами проти RSK1/2/3 або IgG кролика, а обложені білки імуноблотували антитілами до фосфо-T359-S363 ( c ). ( d - F ) Денатуровані екстракти R та M клітин ПК-3мм2 обробляли, як описано на малюнках 8а-с.

Повнорозмірне зображення

Обговорення

RSK є широко вираженим ефектором вниз каскаду MAPK. У цьому дослідженні ми демонструємо, що як рекомбінантний RSK, так і RSK у яйцеклітині Xenopus екстрагують фосфорилюють усі три ізоформи hCdc25 в консервативному мотиві поблизу каталітичного домену. У клітинних лініях людини RSK переважно фосфорилює Cdc25A та Cdc25B в мітотичних клітинах. Фосфорилювання сайтів RSK у hCdc25A та hCdc25B збільшує їх активність, що викликає М-фазу. Активація Cdc25, опосередкована RSK, відіграє позитивну роль у переході G2/M. Крім того, RSK, швидше за все, буде більш активною в мітотичних клітинах. . Ці висновки визначають новий зв'язок між активацією каскаду MAPK та регулюванням переходу G2/M.

RSK включає сімейство структурно споріднених кіназ, що складається з RSK1, RSK2, RSK3 та RSK4. Серед чотирьох ізоформ RSK1, RSK2 та RSK3 широко експресуються в тканинах та клітинних лініях людини (5,7,48) і, ймовірно, фосфорилюють субстрати, що перекриваються. Отже, RSK, про який йдеться у цьому дослідженні, включає принаймні RSK1, RSK2 та RSK3. Однак ми також усвідомлюємо, що різні ізоформи RSK можуть мати різну роль у певних аспектах регуляції клітин. 59, 63 Отже, ми не можемо виключати можливість того, що різні ізоформи RSK по-різному сприяють фосфорилюванню hCdc25A та/або hCdc25B під час переходу G2/M. Для уточнення цієї проблеми буде необхідний детальний аналіз різних ізоформ. RSK при фосфорилюванні hCdc25A та hCdc25B in vitro та in vivo .