предметів

реферат

EBI2 - це рецептор, зв'язаний з G білком, активований оксистеролом 7a, 25-дигідроксихолестерином (7a25HC) і регулює реакцію антитіл, залежних від Т-клітин, і міграцію В-клітин. Нещодавно ми виявили, що EBI2 експресується в астроцитах людини, регулює внутрішньоклітинну сигналізацію та модулює міграцію астроцитів. Тут ми повідомляємо, що лікування ЛПС в мишачих астроцитах змінює рівні EBI2 та оксистеролу мРНК, припускаючи, що сигнальний шлях EBI2 чутливий до опосередкованого ЛПС імунного виклику. Ми також виявили, що кондиціоноване середовище, отримане із стимульованих LPS астроцитів миші, індукує міграцію макрофагів, яка інгібується антагоністом EBI2 NIBR189. Ці результати демонструють роль сигнального шляху EBI2 в астроцитах як датчика для імунної стимуляції та для зв'язку з вродженими імунними клітинами, такими як макрофаги.

Щоб визначити інші ролі в сигнальному шляху EBI2 в астроцитах, ми дослідили його модуляцію за допомогою LPS в астроцитах миші. Ми також дослідили, чи відіграє роль передача сигналів EBI2 у клітинному зв'язку астроцитів з макрофагами.

результат

LPS-стимульоване середовище миші, обумовлене астроцитами, індукує міграцію макрофагів

Зростає кількість доказів того, що астроцити продукують ряд сигнальних молекул (цитокіни, хемокіни, фактори росту, оксид азоту та інші), які дозволяють спілкуватися з вродженими імунними клітинами і, можливо, сприяють їх міграції24. Спочатку ми прагнули продемонструвати, що стимульовані LPS астроцити можуть індукувати міграцію вроджених імунних клітин, і в цьому дослідженні ми зосередилися на їх здатності регулювати міграцію макрофагів. Середовища, доповнені 7α25HC (0,01 мкМ) або зібрані з LPS (100 нг/мл, 0-24 год) мишачих астроцитів (LPS-Astro-Med), наносили в нижню камеру міграційної системи трансплантатів xCELLigence®, що містить макрофаги RAW264. 7 клітин у верхній камері (рис. 1а). Цей LPS-Astro-Med викликав значну міграцію клітин макрофагів RAW264.7 залежно від часу порівняно з необробленими астроцитами (192,2% +/- 50,2% через 6 годин, 211,0% +/- 66,5% через 8 годин) (рис. . 1b). Середовища з оброблених LPS астроцитів протягом 2, 4 та 24 годин не викликали міграції макрофагів, вказуючи часову реакцію, а також вказуючи на те, що доданий лише LPS не безпосередньо змінює міграцію макрофагів у цих серіях експериментів (рис. 1b).

ebi2

Лікування первинних астроцитів миші LPS (100 нг/мл), індукованих рівнями 25HC через чотири та вісім годин ( a ) 7a25HC через вісім та 15 годин ( b ) та 7p25HC через чотири, вісім та 15 годин ( c ). Дані представлені як середнє значення +/− SEM, n = 3 - 6. одностороння ANOVA з пост-тестами Даннета, * p> 0,05, ** p> 0,01, *** p> 0,001 проти відповідного контролю.

Повнорозмірне зображення

EBI2 регулює міграцію макрофагів, спричинену кондиціонованим середовищем мишачих астроцитів

Нарешті, щоб визначити, чи спостерігаються ефекти міграції, викликані LPS-Astro-Med, залежали від EBI2, середовище доповнювали антагоністом EBI2 (NIBR189, посилання [30], 10 мкМ). Показано, що ефекти оксистеролів на міграцію макрофагів частково пригнічуються антагоністом EBI2 (NIBR189), що вказує на опосередковану EBI2 сигналізацію 12. Відповідно до цього попереднього дослідження 12, антагоніст EBI2 NIBR189 пригнічував вплив 7α25HC на міграцію макрофагів (109,5% +/- 57,9%), який екзогенно застосовувався до нижньої камери міграційної системи xCELLigence®. Важливо, що кондиціоновані середовища, зібрані із стимульованих LPS астроцитів протягом 6 та 8 годин (LPS-Astro-Med) та доповнені антагоністом EBI2 (NIBR189), послаблюють спостережувану міграцію макрофагів (рис. 4). Для цього ефекту спостерігалася тенденція до зниження, що свідчить про часткову участь EBI2 у регуляції міграції макрофагів (рис. 4). Загалом, дані свідчать про те, що стимульовані LPS астроцити можуть індукувати міграцію макрофагів і, крім того, що EBI2 може регулювати цю клітинну перехресну перешкоду.

Експериментальну установку можна знайти на рис. Як 7α25HC (0,01 мкМ), так і кондиційоване астроцитами середовище, отримане від 6 та 8 годин оброблених LPS мишей-астроцитів, індукували міграцію макрофагів. Додавання антагоніста EBI2 (NIBR189, 10 мкМ) до 7α25HC або обробленого LPS мишачого астроцитарного середовища послаблювало вплив опосередкованого астроцитами середовища на міграцію макрофагів. Дані представлені як середнє значення +/− SEM n = 3, одностороння ANOVA з Бонферроні після тестів, * p 21 показали, що дефіцитні Ch25h макрофаги мають протизапальний фенотип, а тварини мають порушений перебіг EAE, Chalmin та його колеги 26 встановили, що видалення Ch25h значно послаблює перебіг хвороби EAE, обмежуючи передачу патогенних CD4 + Т-клітин до центральної нервової системи. Також було показано, що сигнальний шлях EBI2 (зокрема рецептор та 7a25HC та його метаболічні ферменти) реагує на імунну реакцію у первинних макрофагах, отриманих з моноцитів 12. У цьому дослідженні ми вивчали сигналізацію та функціонування EBI2 у астроцитах миші та продемонстрували роль EBI2 у клітинному зв'язку між астроцитами та макрофагами.

Тут ми виявили, що у відповідь на LPS первинні астроцити миші значно знижують експресію мРНК EBI2. Наші дані також показали, що астроцити мишей регулювали рівні мРНК 7a25HC, що синтезує і розкладає ферменти у відповідь на виклик з LPS. Ми можемо лише припускати причини відносно повільніших тимчасових активацій CYP7B1 та HSD3B7 порівняно з активацією CH25H, яка в даний час залишається незрозумілою. Важливо, що ці дані узгоджуються з експресією мРНК цих ферментів у оброблених LPS макрофагах, вказуючи на те, що експресія CH25H досягає піку через дві години, мРНК CYP7B1 може спостерігатися під час лікування LPS, а транскрипти CYP27A1 та HSD3B7 регулюються протягом двох або більше годин . шостої години 12 .

Ми виявили, що регуляція синтетичних ферментів супроводжувалася регуляцією рівнів 7a25HC у середовищі, обробленому астроцитами миші, після обробки LPS. Висновки про те, що LPS підвищував рівні 7a25HC у середовищі, що кондиціонується астроцитами миші, були пов’язані зі здатністю цього середовища сприяти міграції макрофагів. Ми також виявили, що кондиціоноване середовище, отримане із стимульованих LPS астроцитів, індукує міграцію макрофагів, яка частково послаблюється антагоністом EBI2 NIBR189. Таким чином, регуляція сигнального шляху EBI2 (як рецептором, так і ферментами, що контролюють рівень ліганду) в астроцитах, схоже, сприяє міграції клітин макрофагів.

Підсумовуючи, дані свідчать про те, що молекули в сигнальному шляху EBI2 чутливі до прозапальних сигналів і що EBI2 відіграє певну роль у спілкуванні між астроцитами та макрофагами.

методи

Культура клітин

Усі процедури на тваринах були схвалені Комітетом інституційної етики (Novartis Pharma, Базель, Швейцарія та Трініті-коледж, Дублін, Ірландія). Методи проводились відповідно до затверджених керівних принципів. Астроцити мишей 27, 28, 29, 30 та клітини макрофагів миші (RAW264.7) 12 культивували, як описано вище. До стимуляції астроцити голодували в безсироватковому середовищі протягом 4 годин. Потім астроцити обробляли LPS (100 нг/мл, Sigma) з антагоністом EBI2 або без нього (NIBR189, Novartis) 31 та/або 7a25HC (готували у вигляді 10 мМ вихідного розчину в 90% DMSO).

Кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі (RT-qPCR)

Високоефективна рідинна хроматографія та тандемна мас-спектрометрія (UHPLC-MS/MS)

Міграційні тести

Міграцію мишачих макрофагів (RAW264.7) проводили при 37 ° C і 5% CO 2 у зволоженому інкубаторі з використанням керованої платформи xCELLigence® (Roche Applied Biosciences) з 16-лунковими CIM-планшетами, як описано вище 22. Коротко кажучи, міграція комірок через електродну решітку з верхньої в нижню камеру вимірюється збільшенням імпедансу. Нижня камера пластини була заповнена або обробленою астроцитами, або безсироватковою середовищем, доповненою 7α25HC (0,01 мкМ) з або без антагоніста EBI2 NIBR189 (10 мкМ). Міграцію клітин реєстрували відразу після вставки пластини та записували протягом 2 годин.

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Рутковська, А. та ін. Сигнальний шлях EBI2 відіграє роль у перехресних зв’язках клітин між астроцитами та макрофагами. Наук. Респ. 6, 25520; doi: 10.1038/srep25520 (2016).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.