предметів

реферат

В останні десятиліття частота ожиріння зростає 1. За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я, ожиріння та надмірна вага пов’язані з більшою кількістю смертей із недостатньою вагою у всьому світі. Ожиріння та його метаболічний синдром стали проблемами здоров’я, соціальними та економічними проблемами. Ожиріння характеризується надмірним накопиченням жирової тканини в організмі 2; тоді як центральне ожиріння з жировою тканиною накопичується в основному в черевному підшкірному та вісцеральному депо 3, 4. Ці підшкірні жирові тканини тісно пов’язані з інсулінорезистентністю 3, 4, 5, а люди з ожирінням схильні до метаболічних ускладнень 3 .

Канонічна роль адипоцитів полягає в тому, щоб служити регулятором для підтримки енергетичного балансу в організмі 6. Триацилгліцерин (ТГ) зберігається в цитозольних краплях ліпідів в адипоцитах під час надлишку енергії і мобілізується для виділення жирних кислот за допомогою ліполізу, коли потрібна енергія або під гормональним впливом 7. Однак ожиріння завжди пов'язане зі зниженою реакцією на стимульований катехоламіном-8 ліполіз, оскільки у людей із ожирінням порушений бета-адренергічний рецептор-8-ліполіз. Адипоцити людей, що страждають ожирінням, мають нижчий рівень активності аденилілциклази в умовах гормонального стимулювання, порівняно з адипоцитами з контролю ожиріння 9, 10. Дослідження показало, що після стимуляції дибутирилом цАМФ максимальна ліполітична здатність була нижчою в адипоцитах, виділених від людей із ожирінням, ніж у адипоцитах, виділених від осіб, що не страждають ожирінням 8. Цей висновок додатково свідчить про те, що адипоцити пацієнтів із ожирінням мають ліполітичну відповідь на бета-адренергічну стимуляцію.

Шизандрин B (SchB) - одне з найпоширеніших та найактивніших похідних дибензоциклооктадієну, знайдених у плодах Schisandra chinensis. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill знаходиться в північному Китаї, Японії, Кореї та прилеглих районах Росії і використовується як фітотерапія в охороні здоров'я 18. На сьогоднішній день повідомляється, що SchB має гепатопротекторні властивості 19, 20, зменшує вміст ліпідів у печінці 21, покращує гомеостаз глюкози та підвищує чутливість до печінки22. Однак його функціональна роль у регуляції ліпідного обміну адипоцитів не вивчена. У цьому дослідженні ми досліджували функціональну роль SchB у зменшенні підшкірної жирової клітковини шляхом регулювання метаболізму ліпідів адипоцитів.

результат

SchB знижує вміст ліпідів у адипоцитах 3T3-L1

SchB є похідним дибензоциклооктадієну (рис. 1а). Спочатку ми використали UHPLC-аналіз для підтвердження чистоти SchB, яка становила 97% (рис. 1b).

шизандрин

Шисандрін Б. ( a ) Будова Шизандріна В (SchB); ( b ) хроматограма SchB в аналізі UHPLC.

Повнорозмірне зображення

У цьому дослідженні ми досліджували, чи регулював SchB ліпідний обмін у білих адипоцитах. Ми використовували адипоцити 3T3-L1 як модель in vitro. Щоб визначити субцитотоксичну концентрацію SchB для експериментів, ми обробляли адипоцити 3T3-L1 SchB при різних концентраціях протягом 24 годин та проводили аналіз MTT. Як показано на фіг. 2а, IC 50 SchB для адипоцитів 3T3-L1 становив 172,8 мкМ. Потім ми обробляли адипоцити 3T3-L1 SchB при 80 мкМ на п’ятий день під час диференціації. Цікаво, що ми виявили, що SchB зменшує кількість крапель ліпідів (рис. 2b) та вміст ліпідів у цих адипоцитах (рис. 2c, d). Ці дані свідчать про те, що SchB регулює метаболізм ліпідів у адипоцитах 3T3-L1.

SchB знижує вміст ліпідів у адипоцитах 3T3-L1. a ) Аналіз життєздатності клітин SchB на адипоцитах 3T3-L1. ( b ) Ліпідні краплі в контролі та оброблені SchB (80 мкМ) адипоцити 3T3-L1. Кількісне визначення фарбування ліпідів у контрольних і оброблених SchB адипоцитах 3T3-L1 за допомогою ( c ) Олія червона O a ( d ) Ніл Червоний. Показані середні значення ± SE, n = 3 індивідуальних експерименти. * стор

SchB індукує ліполіз в адипоцитах 3T3-L1. ( a ) Представник Вестерна демонструє експресію білка ATGL, HSL та фосфо-HSL у контролі та оброблених SchB (80 мкМ) адипоцитах 3T3-L1 та ( b ) кількісне визначення західного сигналу для HSL та p-HSL. ( c ) рівні цАМФ у контролі та адипоцитах 3T3-L1, оброблених SchB. Показані середні значення ± SE, n = 3 індивідуальних експерименти. * p a p b p

SchB збільшує експресію генів окислення жирних кислот в адипоцитах 3T3-L1. a ) Експресія ацил-КоА оксидази 1 (Акокс1), малатдегідрогенази 2 (Mdl2), карнітину пальмітоїлтрансферази 1 (CPT1), субодиниці цитохрому с оксидази VIIIb (Cox8b), дуже довголанцюгової ацил-КоА дегідрогенази (Acadvl) o (80 мкМ) адипоцити 3T3-L1. Показані середні значення ± SE, n = 3 індивідуальних експерименти. * p 7, 12, 13, 14, 16, ми створили мишачу модель індукованої ожирінням дієти (DIO) для досліджень ex vivo та in vivo, щоб дослідити вплив SchB на метаболізм ліпідів адипоцитів. У цьому дослідженні ми використовували мишачу модель DIO, оскільки ці миші DIO не є генетично інженерними. Крім того, вони імітують поточну поширеність ожиріння, коли більшість людей розвивають ожиріння при надмірному споживанні калорій. Ми визначили модель миші DIO, годуючи мишей C57BL/6 з високим вмістом жиру (HFD) або відповідну контрольну дієту протягом 12 тижнів. Як показано на фіг. 6а, починаючи з 10 тижня, маса тіла мишей, яких годували HFD, була значно більшою, ніж вага мишей на контрольній дієті (рис. 6а). Відсоток приросту ваги становив 62,06 ± 5,55% для мишей, яких годували HFD, і 33,49 ± 3,41% для мишей, яких годували контрольною дієтою, яку годували 12 тижнів.

Миші, індуковані дієтою, спричиненою ожирінням. ( a ) Вага тіла та ( b ) різні ваги жирових депо у мишей DIO. Підшкірна жирова тканина (SAT), епідидимальна жирова тканина (EAT), околопочечная жирова тканина (PAT) та коричнева жирова тканина (BAT) у мишей DIO. Показано середнє значення ± SE, n = 10 мишей у кожній групі. * стор

SchB збільшує ліполіз в жирових прокладках, відокремлених від мишей DIO в дослідженні ex vivo. ( a ) Репрезентативний вестерн демонструє експресію HSL та β-HSL у підшкірних адипоцитах, розділених від мишей DIO та ( b ) кількісна оцінка західних сигналів. NEFA випущено в ( c ) підшкірна жирова тканина (SAT), ( d ) епідидимальна жирова тканина (EAT) і ( e ) периренальна жирова тканина (PAT), розсічена від мишей DIO. Показано середнє значення ± SE, n = 5 окремих експериментів. * p a p b p

Підшкірна жирова тканина тісно пов'язана з метаболічним синдромом 3, 4, 5. Накопичення підшкірної жирової тканини у людей, що страждають ожирінням, частково зумовлене стійкістю підшкірних адипоцитів до ліполізу 3. HSL контролює регуляторний етап у ліполізі 11, експресія та активність HSL нижчі у підшкірних адипоцитах, ніж у адипоцитах з інших жирових депо 25. Крім того, підшкірні адипоцити мають нижчу чутливість до індукованого катехоламінами ліполізу та вищу чутливість до антиліполітичних ефектів інсуліну порівняно з іншими адипоцитами 3. Тому обмежене споживання їжі та фізичні вправи зазвичай зменшують вісцеральну жирову тканину набагато більше, ніж підшкірну жирову тканину 3, 26. Крім того, у стані ожиріння, який супроводжується резистентністю до інсуліну, індукований катехоламінами ліполіз білих адипоцитів, як правило, порушується 15, 27, що також призводить до накопичення жирової тканини у людей із ожирінням.

Наше дослідження показало, що SchB збільшує ліполіз та експресію генів окислення жирних кислот у підшкірних адипоцитах у мишей DIO, пропонуючи новий терапевтичний підхід для зменшення підшкірної жирової тканини у людей із ожирінням. Sch B - природна сполука, виділена з нетоксичних китайських лікарських трав. Дослідження на тваринах показали, що тривале лікування SchB не має помітного побічного ефекту28. Наші дані також показали, що лікування SchB не викликало спостережуваних несприятливих ефектів у мишей або викликало апоптоз в адипоцитах (дані не наведені), що свідчить про те, що SchB є безпечним терапевтичним засобом.

Рівні SchB після введення Schisandra вимірювали в плазмі миші, і дані показали, що SchB був максимальним у шлунку через 15 хвилин після внутрішньошлункового введення і досяг максимальних концентрацій у всіх тканинах через 2 години після введення. Після внутрішньовенного введення SchB в основному розподілявся у плазмі, печінці та нирках через 15 хвилин після ін’єкції. Ці дослідження свідчать про те, що SchB не є токсичним на моделях тварин. Розподіл SchB у підшкірній жировій тканині після внутрішньошлункового введення або внутрішньовенних ін’єкцій не вивчався 36. У нашій експериментальній розробці ми використовували підшкірну ін’єкцію, яка може допомогти локалізувати Sch B у підшкірній жировій тканині для досягнення максимального ефекту проти ожиріння. Доза 0,4 г/кг для мишей відповідає дозі для людини 0,03 г/кг. На основі опитування рослинних лікарських засобів (HMC), опублікованого Фармакопейною конвенцією США (USP), екстракт висушених стиглих плодів Schisandra chinensis (Turcz.) В заставі міститься не менше 90% і не більше 110% загальної кількості лігандів, включаючи \ t шизандрин B (у- шизандрин, C23H28O6), шизандрол B (C23H28O7) та шизандрин A (дезоксишизандрин, C24H32O6) на сухій основі. Дослідження також показало, що вміст лігнану в десяти зразках Schinsandra chinensis, зібраних з різних районів Китаю, різнився 37 .

Наше дослідження чітко продемонструвало метаболізм ліпідів, що регулюється SchB, адипоцитарний ліпід, посилення активності HSL, опосередковану РКА, збільшення вивільнення жирних кислот та експресію генів окислення жирних кислот у підшкірних адипоцитах у мишей DIO. Наші дані висвітлюють можливе терапевтичне використання насіння Sch B або Schisandra chinensis, що містять Sch B, для зменшення ожиріння і, отже, пов’язаних із ожирінням станів, пов’язаних із ожирінням.

Матеріали і методи

матеріалів

Schisandrin B (SchB) був придбаний у Ningli Technology Co. Ltd. (Куньмін, Китай). Адипоцити 3T3-L1 були придбані в Американській колекції типових культур (ATCC). Модифіковане ефірне середовище (DMEM) Дульбекко, теляча сироватка плода, пеніцилін, стрептоміцин, збалансований сольовий розчин Хенка (HBSS) та Fluo-3/AM були придбані у компанії Life Technologies Limited. Антитіла до тригліцерид-ліпази адипоцитів (ATGL), гормоночутливої ​​ліпази (HSL), β-HSL (серин 563 та серин 565), розщепленої каспази 3 та GAPDH придбані у Cell Signaling або Santa Cruz Biotechnology Inc. ізопротеренол, вільний гліцериновий реагент, глюкоза, BSA без жирних кислот, червоне масло O, червоний Ніл, гематоксилін та еозин, диметилсульфоксид та 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифеніл тетразолій бромід (MTT ) були придбані у Sigma-Aldrich Chemical Co. H89 був придбаний Calbioch. CAY10499 був придбаний у Cayman Chemical. Усі органічні розчинники мали ВЕРХ марки Sigma-Aldrich Chemical Co.

Культура клітин 3T3-L1 та диференціація адипоцитів

Адипоцити 3T3-L1 культивували в модифікованому Дульбекко ефірному середовищі (DMEM), що містить 25 мМ глюкози, і доповнювали 10% фетальної телячої сироватки та 100 МО/мл пеніциліну G та 0,1 мг/мл стрептоміцину. Для індукування диференціації злиті клітини 3T3-L1 обробляли диференційованим коктейлем, що містив 1 мкМ дексаметазону, 0,5 мМ метилізобутилксантану та 1,7 мкМ інсуліну. Через 48 годин коктейль для диференціації замінили інсуліносодержащим середовищем для підтримки протягом 2 днів, перш ніж перейти на культуральне середовище без інсуліну 34 .

Поводження з тваринами

Усі експерименти на тваринах були схвалені та проведені відповідно до керівних принципів Університету баптистського університету Гонконгу та затверджені Комітетом з досліджень людини та тварин університету та Міністерством охорони здоров'я, Спеціальний адміністративний регіон Гонконгу. Ми придбали самців мишей C57BL/6 (C57) 5 тижнів у Китайському університеті Гонконгу. Мишей випадковим чином відбирали для того, щоб вони мали або контрольну дієту (D12450J Research Diets), або дієту з високим вмістом жиру (D12762 Research Diets), яку використовували для стимулювання ожиріння. Дієта та вода давались за бажанням. Масу тіла кожної миші реєстрували щотижня. Після 12-тижневого дієтичного втручання в експериментах використовували встановлені моделі ожиріння, спричиненого дієтою (DIO). Для експериментів in vivo мишам DIO вводили або SchB підшкірним введенням 0,4 г/кг/добу в 0,02 мл диметилсульфоксиду, або лише носій (0,02 мл диметилсульфоксиду) в якості контролю протягом 5 днів. Зміни поведінки, вага тіла та споживання їжі цих мишей реєстрували щодня.

Виділення адипоцитів

Виділення адипоцитів із жирової тканини проводили, як було описано в іншому місці 38. Коротко, жирова тканина, зібрана у мишей, перетравлювалася протягом 1 години при 37 ° C з колагеназою в буфері Кребса-Рінгера (KRB; 12 мМ HEPES, 121 мМ NaCl, 4,9 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4 та 0,33 мМ CaCl 2) з додаванням 3 мМ глюкози та 1% BSA без жирних кислот, фільтрують через капронову сітку. Адіпоцити видаляли з верхньої фази після центрифугування. Ізольовані адипоцити підраховували за допомогою гемоцитометра 39 .

ліполіз

Жирові прокладки від мишей DIO вирізали та розрізали на зразки 50 мг та інкубували при 37 ° C без струшування у KRB (12 мМ HEPES, 121 мМ NaCl, 4,9 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 0,33 мМ CaCl 2), що містять 2% жиру кислоти. BSA та 0,1% глюкози 38 у присутності SchB або носія. В цей момент часу вимірювали вивільнення NEFA та гліцерину в аликвотах інкубаційного буфера за допомогою набору LabAssay NEFA (Wako Chemicals) та вільного гліцеринового реагенту, відповідно. Для вимірювання ліполізу в адипоцитах 3T3-L1 клітини промивали KRB та інкубували KRB з додаванням 2% BSA без жирних кислот та 0,1% глюкози у присутності SchB або носія. Ізопротеренол використовували як позитивний контроль. У цей момент часу вимірювали вивільнення NEFA та гліцерину в аликвотах інкубаційного буфера з використанням набору LabAssay NEFA та вільного гліцеринового реагенту. Кожне лікування проводилось у трьох примірниках.

Тест на життєздатність клітин

Цитотоксичність SchB на адипоцитах 3T3-L1 оцінювали за допомогою аналізу 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифенілтетразолію броміду (МТТ). Клітини в 96-лункових планшетах обробляли SchB і до кожної лунки після інкубації додавали 20 мкл розчину МТТ (5 мг/мл). Далі планшети інкубували при 37 ° С протягом 4 годин перед додаванням 100 мкл ДМСО. Оптичне поглинання визначали при 570 нм за допомогою мікропланшетного спектрофотометра. Кожне лікування проводилось у трьох примірниках.

Масляне фарбування Червоний O

Адипоцити 3T3-L1 при обробці носієм або SchB фарбували свіжоприготованим робочим розчином Oil Red O протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Для кількісного визначення фарбування жирний Red-O екстрагували з клітин ізопропанолом, що містить 4% нонідету P-40, а потім вимірювали оптичну щільність при 520 нм 40. Кожне лікування проводилось у трьох примірниках.

Нілово-червоне забарвлення

Адипоцити 3T3-L1 при обробці носієм або SchB фарбували 1 мкМ Nile Red у збалансованому розчині солі Хенка (HBSS) протягом 15 хвилин. Зразки 10000 клітин, зафарбованих червоним кольором Нілу, підраховували за допомогою проточного цитометра (BD Bioscience) 41. Кожне лікування проводилось у трьох примірниках.

Фарбування гематоксиліном та еозином для підшкірної жирової тканини

SAT фіксували у 10% забуференному формаліні, вкладали у парафін, розрізали на ділянки товщиною 6 мкм і фарбували гематоксиліном та еозином. .

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано. Коротко кажучи, нітроцелюлозну мембрану, що містить перенесені білки, інкубували при температурі 4 ° С протягом ночі з відповідним антитілом 1: 1000. Імунодетекцію проводили за допомогою вторинного антитіла, кон'югованого з пероксидазою хрону, з подальшою системою виявлення ECL (Amersham).

Аналіз ланцюгової реакції полімерази в режимі реального часу

Загальну РНК екстрагували реактивом Trizol (Invitrogen) та обробляли ДНКазою 1 (Invitrogen). РНК (2 мкг) реверсували транскрипцію оліго-dT з використанням зворотної транскриптази M-MLV (Promeg) згідно з протоколом виробника. ПЛР у реальному часі проводили із застосуванням зеленої реакційної суміші SYBR в швидкій ПЛР-системі в режимі реального часу ABI 7500 (Applied Biosystemsm). Дані про експресію генів нормалізували до ендогенного контролю бета-актину. Відносні рівні експресії генів вимірювали за формулою 2-ACt, де ACt - різниця в значеннях порогових циклів між мішенями та β-актином. Всі зразки аналізували в трьох примірниках.

визначення цАМФ

Рівні CAMP в адипоцитах вимірювали, як описано в 42. Коротко, адипоцити 3T3-L1 обробляли або SchB при зазначеній концентрації, або носієм як контролем протягом 6 годин. Потім адипоцити промивали PBS і лізували для вимірювання цАМФ імунологічним аналізом (BioVision) відповідно до інструкцій виробника. Кількість білків адипоцитів у кожній групі вимірювали методом Бредфорда. Кожне лікування проводилось у трьох примірниках.

Підготовка зразка для РХ/МС

Адипоцити 3T3-L1 обробляли 120 мкМ SchB або DMSO як носій протягом 24 годин. З цих клітин витягували ліпіди для ліпідомічного дослідження. До кожної проби додавали 0,3 мл 0,5 М KH 2 PO 4, 1,5 мл хлороформу та 0,5 мл метанолу. Після вихрового переміщення протягом 2 хвилин і центрифугування при 2000 х г нижню фазу відокремлювали і випаровували під потоком азоту. Залишок відновлювали в 100 мкл ізопропанол-ацетонітрилу (1: 9, об/об) для аналізу LC/MS 43. .

LC/MS аналіз та обробка даних

Дякую

Ця робота була частково підтримана Фондом досліджень охорони здоров'я (HMRF/14-15/03), Гонконгським баптистським університетом присуджується FRG2/14-15/017, FRG2/16-17/076 та FRG2/16-17/010 інновації та технології в Гонконзі (UIM/290) та Consun Pharmaceutical Group Limited.

Електронний додатковий матеріал

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.