Серхіо Уго Санчес-Родрігес 1, Олена Донаджі Рамірес-Альварадо 2, Херардо Енріке Барахас-Васкес 3, Сезар Сальвадор Кардона-Фелікс 4

1 доктор фізіологічних наук. Відділ клітинної біології. Академічний підрозділ експериментальної біології. Автономний університет Сакатекаса.

2 магістр наук (біологія). Відділ клітинної біології. Академічний підрозділ експериментальної біології. Автономний університет Сакатекаса.

3 Магістр наук (біологія). Відділ клітинної біології. Академічний підрозділ експериментальної біології. Автономний університет Сакатекаса.

4 Студент (Q.F.B.). Факультет хімічних наук. Автономний університет Сакатекаса.

Автор-кореспондент: Серхіо Уго Санчес-Родрігес
Відділ клітинної біології
Електронна пошта: [електронна пошта захищена]

Анотація

Ключові слова

Hsp, стрес, середовище середовища

Вступ

Всі організми страждають від стресу навколишнього середовища, і найбільш пристосовані пристосовуються, концепція, яка передбачає, що адаптація є мірою пристосування людини до свого оточення; Іншими словами, адаптація - це ступінь адаптації обмінних процесів людини до особливостей середовища. [1]

Загалом термін стрес використовується у фізіології для позначення протилежності самопочуттю. [2] Таким чином, стрес розглядається як вплив будь-якої сили, яка має тенденцію розширити будь-який гомеостатичний процес за його нормальні межі на будь-якому рівні біологічної організації. [3]

Зрозуміло, що стрес є агентом, який викликає реакцію на стрес, маючи не тільки фізичну природу, але також може бути емоційним, таким як ненависть, гнів чи страх, серед інших. Насправді, психологічна стимуляція є одним із найпоширеніших пускових механізмів. [4]

Стрес може бути кліматичним, наприклад, сильний холод або спека, харчовий, соціальний або хвороба. [5] В екологічному плані стрес виникає, коли фізичні, хімічні та/або біотичні фактори виштовхують організм за межі його основної ніші. [3]

Несприятливі умови в організмі, обумовлені навколишнім середовищем, поведінковими звичками чи харчуванням, опосередковуються через нервову та ендокринну системи і допомагають організмам уникнути стресу. [6] Пристосування до стресу викликає широкий спектр нейроендокринних, психологічних та поведінкових змін, які дозволяють швидко відновитись або адаптуватися, необхідні для підтримки внутрішнього гомеостазу. [7,8]

Також виявлено, що група білків, відомих як білки теплового шоку (Hsp) або білки стресу, допомагають організмам на клітинному рівні протидіяти стресу. [9-14] Hsp індукуються різними стресовими факторами, [15,16] серед яких: гіпоглікемія, аноксія, спека, етанол, перекис водню, іони важких металів, миш'яки, інфекції певними вірусами, [17,18] аутоімунні захворювання такі як системний червоний вовчак [19] через дефіцит їжі та води, [20] ультрафіолетове випромінювання, низькочастотне електромагнітне випромінювання, напружені поля гамма-випромінювання [21,22] та гамма-промені низької інтенсивності. [2. 3]

Навколишнє середовище є стресовим фактором для всіх організмів, і зокрема, завдяки своєму способу життя людина може спричинити більший стрес для свого організму через звички чи звикання під час їх розвитку. Найвідомішими шкідливими звичками є алкоголізм, куріння, порушення дієти, наркоманія (різноманітна), надмірні фізичні навантаження, сидячий спосіб життя тощо.

У цьому проекті було вивчено, які фізіологічні механізми активізують люди, що дозволяє їм адаптуватися до різних видів стресу, таких як: фізичні вправи, ожиріння та хімічні речовини (тютюн та алкоголь). Для цього ми зосереджуємося на вивченні білків калорійного шоку Hsp70 та 90, оскільки він нормально експресується у всіх організмах від бактерій, дріжджів та людини. [13,24] Роль Hsp70 полягає у захисті клітини від пошкодження стресом шляхом зв’язування з частково денатурованими білками, дисоціації білкових агрегатів та регулювання правильного згортання та внутрішньоклітинної транслокації синтезованих білків de novo. [25,26] Подібним чином, функція Hsp90 запобігає скупченню білків, що розгортаються під час стресу, і асоціюються з рецепторами стероїдних гормонів, щоб швидко реагувати на сигнали [27], відіграють важливу роль у регуляції ферментів та транскрипції білка. [28] Загалом, Hsp90 служить організатором, який зближує молекули та сприяє їх зв’язуванню. [29]

Метою цього дослідження було: Визначити ступінь стресу, представленого лімфоцитами спортсменів, ожиріння, алкоголіків та курців за допомогою експресії білків теплового стресу Hsp70 та 90.

Матеріал і методи

Досліджувані особи.

Були відібрані особи середнім віком від 18 до 22 років, чоловіки. 4 групи по 4 члени в кожній були сформовані відповідно до їх стану та звичок (курці, страждають ожирінням, які вживали алкоголь в значній мірі та ті, хто робив інтенсивні фізичні вправи, а також група здорових людей).

Отримання лімфоцитів.

Зразки крові досліджуваних були використані для виділення їх лімфоцитів. По 10 мл периферичної крові отримували від кожної особини (Beckton-Dickinson N.J., США, 10 мл пробірки для гепарину). З отриманої крові лімфоцити виділяли за допомогою градієнта Ficoll Histopaque (Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, США, 1077-1), дотримуючись методики, описаної Boyum (1968). [30] Лімфоцити кожної особини культивували в середовищі RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island NY, США, 11876-026), доповненому 100 ОД/мл пеніциліну, 100 нг/мл стрептоміцину (In Vitro, Мексика, DF), 0,08 U/мл інсуліну (Eli Lilly México, DF) та 5% фетальної бичачої сироватки (Gibco BRL, Grand Island NY, США, 16000-044). Від кожної особини життєздатність лімфоцитів визначалася

час їх отримання методом виключення трипанового синього (Sigma Chemical Co, Сент-Луїс, Міссурі, США, T-6146).

Клітинний стрес. Лімфоцити кожної особини в середовищі RPMI були розділені на 3 аликвоти. В якості контролю брали аліквоту для визначення базального рівня Hsp. інший піддавався тепловому стресу в культурі при температурі 40 ° C протягом 3 годин, а інший - ультрафіолетовому світлу, використовуючи світлову лампу UV-A (лампа Black-Ray UVL-56). Опромінення становило 366 нм протягом 3 годин, остаточна отримана доза становила 5-30 мДж/см 2. [31] Після теплового стресу та ультрафіолетового світла життєздатність лімфоцитів була повторно визначена.

Лізис лімфоцитів та SDS-PAGE: Лімфоцити, піддані дії УФ та теплового стресу, промивали 3 рази сольовим розчином фосфату (PBS; рН 7,2) ((Gibco BRL, Grand Island NY, США, 21300-058), додавали 0,5 мл буфера. Лізис, що містить: 1% тритону X-100, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЕДТА, 10 мМ трис-HCl рН 7,6 та 1 мМ інгібітор протеази, PMSF (Sigma Chemical Co, Сент-Луїс, штат Міссурі, США, P-7626) Лізат центрифугували протягом 10 хвилин при 1600 г і супернатант відновлювали і визначали концентрацію білка. [32] Кількісну оцінку білка проводили, використовуючи методику, описану Бредфордом (1976). [33] Для кожного стану експериментально 30 мкг білка характеризували у поліакриламідних гелях (10% SDS-PAGE) за методикою, описаною Леммлі (1970). [34]

Вестерн-клякса та імунодетекція: Білки в SDS-поліакриламідних гелях переносили на нітроцелюлозний папір (Amersham Laboratories, Бакінгемшир, Англія, RPN303C), як описано Towbin (1979). Потім для ідентифікації білків Hsp блот обробляли специфічними моноклональними антитілами проти білків Hsp70 та 90 (Sigma Chemical Co, Сент-Луїс, США, H-4149, H-5147) з розведенням 1: 1000. В якості другого антитіла використовується кон'юговане з пероксидазою анти-мишаче антитіло IgG (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, A-9044) у розведенні 1: 1500, а потім система хемілюмінесцентного виявлення (ECL, RPN2106, Amersham, Little Chalfont, Бакінгемшир, Англія), який був виявлений на рентгенографічній плівці BioMax (Eastman Kodak Co, Рочестер, Нью-Йорк, США, 870-1302) за час 1 хвилини.

Визначення кількості Hsp: Авторадиографи, отримані методом ECL, аналізували за допомогою денситометрії (Eagle Eye, Stratagene Mitsubishi) з метою кількісної оцінки кількості білка. Контрольне значення (здорові особи) віднімали із стресових умов (алкоголь, тютюн, ожиріння та фізичні вправи).

Статистичний аналіз: Білкові смуги Hsp70 та 90, отримані в умовах стресу через алкоголь, тютюн, ожиріння та фізичні вправи, аналізували за допомогою денситометрії, результати, отримані з цього, виражали як середнє значення ± s.e.m., де n - кількість спостережень.

Результати та висновки

Стрес - це широкий термін, який передбачає реакцію організму на загрозу, на яку йому потрібно пристосуватися. [7] Одним із механізмів реагування клітин організму на стрес є білки теплового шоку. [9,10,13,14,36] Основним моментом цього дослідження було оцінити ступінь стресу, який представляють лімфоцити спортсменів, ожиріння, алкоголіків та курців за допомогою експресії білків теплового стресу Hsp70 та 90.

Було встановлено, що лімфоцити, отримані у досліджуваних пацієнтів, конститутивно експресують Hsp70 і 90, де алкоголіки, курці та спортсмени в базальних умовах експресують більше Hsp70, ніж здорові та ожирілі особи (Фігура 1), тоді як Hsp90 експресується набагато більше, ніж Hsp70 в базальних умовах, що є більш очевидним у здорових людей, курців та спортсменів (малюнок 2). Важливо зазначити, що як Hsp70, так і 90 містяться в базальних лімфоцитах, оскільки відомо, що їх експресія в більшості організмів виконує характерні функції клітинного захисту, допомагаючи запобігти денатурації білка під час стресу. білки та їх правильне згортання, а також при внутрішньоклітинній транслокації. [10,37]

стресний

Фігура 1. Експресія Hsp70 та 90 у здорових людей (S), алкоголіків (A), курців (F), ожиріння (O) та спортсменів (D). Умови були такими: Контроль (C), напружений ультрафіолетовим світлом, напружений (40 ° C). PAGE-SDS

Фігура 1. Базова і/або конститутивна експресія лімфоцитів Hsp70 у здорових пацієнтів, курців, алкоголіків, пацієнтів із ожирінням та спортсменів. денситометрія контролів, отриманих за допомогою PAGE-SDS.

Малюнок 2. Базова і/або конститутивна експресія лімфоцитів Hsp90 у здорових пацієнтів, курців, алкоголіків, пацієнтів із ожирінням та спортсменів. денситометрія контролів, отриманих за допомогою PAGE-SDS.

Щоб пробудити клітинну реакцію лімфоцитів на стрес і виміряти їх реакцію за допомогою експресії Hsp, лімфоцити піддавали напрузі ультрафіолетовим світлом, де збільшення експресії Hsp70 спостерігалося у алкоголіків та спортсменів, тоді як для Hsp90 воно вище у спортсменів (малюнок 3 Y 4). Так само в цьому дослідженні калорійний стрес використовували як контроль, оскільки він був індуктором експресії hsp70. [13,14,27] Реакція лімфоцитів на нагрівання була через експресію Hsp70 та 90, які були подібними у здорових людей, курців та ожиріння, із збільшенням кількості алкоголіків та спортсменівмалюнок 3 Y 4). Відомо, що однією з функцій hsp70 в стресових умовах є зв’язування з пошкодженими пептидами та білками, щоб запобігти їх агрегації, сприяючи їх відновленню і тим самим захищаючи клітину від відповідного стресора. [38,39]

Малюнок 3. Експресія Hsp70 в лімфоцитах, що піддаються дії ультрафіолетового світла та тепла. Здорові особи, алкоголіки, курці, ожиріння та спортсмени. Денситометрія PAGE-SDS.

Малюнок 4. Експресія Hsp90 в лімфоцитах, що піддаються дії ультрафіолетового світла та тепла. Здорові особи, алкоголіки, курці, ожиріння та спортсмени. Денситометрія PAGE-SDS.

Попередні результати показують, що експресія складових Hsp70 та 90 та нового синтезу шляхом індукції ультрафіолетовим світлом та теплом була присутня у всіх лімфоцитах досліджуваних, як від здорових пацієнтів, так і від алкоголіків, ожиріння, курців та осіб спортсмен, підтверджуючи те, що інші автори виявили, що ці білки синтезуються під час стресу. [40]

У цьому дослідженні, коли ми пробуджуємо реакцію ультрафіолетовим світлом та теплом у лімфоцитах осіб, які піддаються дії стресових факторів, таких як алкоголь, тютюн та інтенсивні фізичні вправи, ми спостерігали більш високий синтез Hsp, що вказує на те, що лімфоцити підданих осіб на певні стресові фактори вони розвивають більшу реакцію на синтез Hsp. Це явище спостерігалося у деяких організмів, які зазнали дії великої кількості стресових факторів, таких як температура, що змушує їх набувати толерантності до широкого кола стресових факторів. [41] Крім того, Hsp70 є важливим для попереднього кондиціонування певного стресового фактору, оскільки індукція Hsp70 корелює із захистом від подальших пошкоджень. [17,42,43] Синтез білків Hsp необхідний відповідно до температури або стресору, про який йде мова, і варіюється від одного виду до іншого. [9,10]

Загалом спостерігалося збільшення синтезу білків Hsp70 та 90, що вказує на те, що ці білки допомагають протидіяти стресу, оскільки було виявлено, що Hsp70 міститься у всіх досліджуваних організмах - від бактерій, дріжджів та людини, повсюдно розташовані в клітинах, основна функція яких полягає у транспорті та зв’язуванні розгорнутих білків та їх корекції. [44] Hsp70 був першим білком, який, зокрема, індукується стресорами, такими як тепло. [13] Згадується, що організми з толерантністю до тепла висловлюють більше Hsp, ніж менш толерантні організми. [Чотири. П’ять]

З іншого боку, Hsp90 належить до конститутивно більш виражених цитозольних шаперонів, особливо в еукаріотичних клітинах, [13,24], функції яких полягають у запобіганні агрегації денатурованих температурою білків у поєднанні з клітинними компонентами, такими як рецептори стероїдних гормонів., [27,46,47] також відіграють важливу роль у регуляції ферментів та транскрипції білка в клітині. [28]

Лімфоцити курців, алкоголіків та спортсменів виражають більше Hsp, ніж здорові (контрольні) та пацієнти з ожирінням. Це узгоджується з іншими дослідженнями, де було встановлено, що існує тісний взаємозв'язок між підвищеною експресією Hsp та експресією цитохрому P-450 під час стресу через фізичні навантаження, куріння та алкоголізм. Під час стресу експресія Hsp разом з цитохромом P-450 (CYP2E1: метаболізує поліциклічні сполуки “діоксини”) допомагають протидіяти стресу. [48]

Вправи, а також інші стресові фактори, такі як гіпертермія, ішемія, окислювальний стрес, низький вміст глюкози та зміна кальцію та рН, викликають експресію Hsp в клітинах і тканинах. [49] У цьому дослідженні ми виявили збільшення білків Hsp70 та 90 у осіб, які займаються фізичними вправами, і це корелює з тим, що повідомлялося іншими авторами, що інтенсивні та тривалі фізичні вправи збільшують синтез Hsp в таких органах, як серце та скелетних м’язів. [50] Це пояснюється тим, що під час фізичних вправ вільні радикали збільшуються, а потім посилюється експресія антиоксидантних ферментів і збільшується експресія Hsp, що вказує на те, що збільшення окислювально-відновного стану м'яза може подавати сигнал адаптації. [51,52] Вправа стимулює вираження Hsp, благотворно впливаючи на здоров’я. [50,53-56]

Загалом, білки Hsp беруть участь як механізм стійкості до стресу, є загальним для всіх організмів, що надає їм стійкості до ряду стресорів; [6,41], тобто високі температури або інші типи стресових факторів допомагають організмам у майбутніх стресових умовах мати більшу стійкість. Це пов’язано з тим, що толерантність організмів до стресора може бути природною чи індукованою [38], де синтез Hsp бере участь як механізм клітинної відповіді. [36] Вираз Hsp змінюється залежно від способу життя, який ведуть люди, допомагаючи протидіяти стресу.