частоти

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Зменшення обсягу їжі викликає фазовий зсув у периферійних годинах
  • Частота прийому їжі з однаковими інтервалами прийому їжі не впливає на фазу периферійного годинника
  • Харчові схеми, що імітують дієту людини, змінюють фази периферійного годинника
  • обговорення
  • методи
  • звір
  • Протокол моніторингу у природніх умовах
  • Аналіз даних моніторингу у природніх умовах
  • Протокол планового годування
  • Статистичний аналіз
  • Коментарі

предметів

  • Експресія гена
  • Регуляція генів
  • візуалізація
  • фізіологія

реферат

Периферійний циркадний годинник у ссавців сильно захоплюється світло-темними та циклами прийому їжі. Їх фізіологічні функції підтримуються за допомогою фазової синхронізації органів за допомогою моделей експресії генів для годинників. Однак про адаптацію периферійних годинників до часу багатоденного харчування мало що відомо. Тут ми дослідили вплив нерегулярних харчових звичок з точки зору часу та обсягу на їх периферійні години in vivo. Ми виявили, що фаза периферійного годинника змінювалася кількістю їжі та інтервалом між часами годування, але частота годування не впливала на те, поки інтервал залишався фіксованим. Крім того, наші результати показують, що пізню вечерю слід розділити на два напівпансіони, щоб пом'якшити ефект нерегулярних фаз периферійного годинника.

Цілодобова годинникова система відіграє ключову роль в ендогенному підтримці фізіологічних функцій, включаючи цикл сну і неспання, температуру тіла, метаболізм та функцію органів 1. Системи годинників ссавців включають гени годинника; зокрема, період 2 (Per2) являє собою транскрипційний та поступальний цикл зворотного зв’язку, який разом з тактовим сигналом, BmaI та Cry1, генерує 24-годинні ритми рівнів РНК та білка на рівні одиничної клітини. Ця система активна не тільки в супрахіазматичному ядрі (SCN), центральному генераторі циркадної годинникової системи ссавців, але і в організмі 1, 2, 3. Аналіз тимчасових мікрочипів у тканинах печінки показав, що приблизно 10% усіх генів демонструють відмінності в денній та нічній експресії, що дозволяє припустити, що ритм фізіологічних подій регулюється циркадною годинниковою системою. .

Використання запланованих експериментів з годуванням мишей для дослідження фазового скидання поведінкових та фізіологічних ритмів, а також ритмів експресії генів годинника свідчить про те, що їжа є потужним фактором захоплення периферійних годинників 1, 3. Це захоплення не залежить від SCN, як повідомляється у дослідженні ураження SCN 17. Печінковий годинник легко засвоюється їжею за допомогою харчових або метаболічних факторів, таких як вуглеводи, амінокислоти 18 та інсулін 19. Раніше ми повідомляли, що прийом їжі або ін’єкція інсуліну різко підвищує регуляцію Per2 і знижує експресію гена Rev-erbα в печінці 19. Тег прийому їжі відрізняється від світлового сліду тим, що тіло отримує сигнали живлення як непараметричні імпульсні сигнали, такі як сніданок, обід та вечеря, тоді як ритми, що залежать від SCN, фіксуються параметричними та непараметричними світловими сигналами. .

Виходячи з цих фактів, метою нашого дослідження було з'ясувати, як окремі імпульси їжі стимулюють периферичний годинник протягом дня і як фаза периферійного годинника регулюється кількома прийомами їжі. Тут ми використовували нещодавно запроваджений метод in vivo для моніторингу периферійних годинників, щоб визначити, як харчові звички, подібні до звичних у людей, визначають фази периферійних годин у мишей.

результат

Зменшення обсягу їжі викликає фазовий зсув у периферійних годинах

У дослідженнях на людях цілодобова парадигма без харчування, як правило, використовується для зменшення захоплення їжею 21; тому ми використали цю парадигму в нашому експерименті, спочатку забезпечуючи мишей 6-разовим прийомом їжі через рівні проміжки часу. Таким чином, ми дослідили вплив обсягу їжі на фазу периферійного годинника, використовуючи цей графік, при якому кожен раз подавали однаковий обсяг їжі за допомогою домашньої автоматизованої системи годування 22. Щоб уникнути залишків протягом періоду годування, в цьому експерименті миші були трохи обмежені в калоріях. Використовуючи методику, описану раніше 23, ми використовували мишей PER2: LUCIFERASE (PER2: LUC) для вимірювання активності Per2 в периферичних тканинах за допомогою візуалізації шкіри in vivo (малюнки 1А та В). За умов годування, за необхідності, активність PER2: LUC у периферичних тканинах (нирках, печінці та підщелепній залозі) була найвищою приблизно за час Цайтґера 19 (ZT 19; ZT 0 вказує час, коли світились лампи; Рисунок 1B) встановили, що 20%, але не 10%, обмеження годування за необхідності було достатнім, щоб спонукати мишей споживати всі свої дієти протягом 4-годинного інтервалу годування. Через сім днів після початку цього протоколу годування миші змогли з'їсти всю доставлену їжу протягом 3 хвилин після надходження їжі.

Схематичні плани годування (ліворуч) та середні фази PER2: пік LUC кожного органу для кожного стану годування (праворуч). Білі та чорні смуги на горизонтальній осі вказують на екологічні 12-годинні умови світла та темряви. Білі кола означають час годування, а розмір кола залежить від обсягу їжі. Всі прийоми їжі розподілялись рівномірно протягом дня, а обсяг кожного прийому їжі протягом дня у групі був рівноцінним; кількість годувань становило 6, 4, 3 або 2 прийоми їжі на день. Через 2 тижні звикання до кожного стану годування контролювали периферійні години. Дані представлені як середнє значення ± SEM, з n = 6 мишей на умову. Одностороння ANOVA не показала значущих відмінностей у жодній з досліджених тканин. Субгла, підщелепна залоза; ZT, час Цайтгебера.

Повнорозмірне зображення

Харчові схеми, що імітують дієту людини, змінюють фази периферійного годинника

Щоб імітувати харчові звички людини, ми зосередились на стані, при якому миші отримували 3-разове харчування. Спочатку ми вивчили різні моменти часу, коли подавали їжу, тобто ZT 12, 18 і 0 або ZT 0, 6 і 12, щоб зрозуміти різницю між денним (ZT 6) і нічним (ZT 18) графіком годування (Рисунок 3A) . Фази периферійного годинника, індуковані годуванням при ZT 0, 6 і 12, суттєво відрізнялися від фаз, викликані годуванням при ZT 12, 18 і 0. Крім того, фаза периферійного годинника мишей, що годувались 3 рази при ZT 12, 18, і 0 був подібний до фази мишей, яких годували ad libitum (Фігури 1 і 3А).

Схематичні плани годування (ліворуч) та середній рівень PER2: пікові фази LUC для кожного органу в умовах годування (праворуч, середнє значення ± SEM). Білі та чорні смуги на горизонтальній осі вказують на екологічні 12-годинні умови світла та темряви. Білі кола означають час годування, а розмір кола залежить від обсягу їжі. Стрілки вказують час годування, який дотримувався найдовшого інтервалу відмови від подачі для кожної умови. Через 2 тижні звикання до кожного стану годування контролювали периферійні години. (А) фаза периферійного годинника у мишей, яких годували 3-разовим прийомом їжі, рівномірно розподіляючи протягом дня та ночі; їжу вводили за ZT 0, 6 та 12 (a) або за ZT 12, 18 та 24 (b); n = 6 мишей за умовою. * с 24; отже, час обіду у цьому дослідженні затримувався. Розміри їжі були такими: сніданок, 0,9 г (27% від загального обсягу їжі); обід, 1,2 г (36%); і вечеря, 1,2 г (36%). На малюнку 3B, фаза периферійного годинника, коли керується програмою подачі ZT 12, 17 та 1, була подібною до фази, коли слідувала програма подачі ZT 12, 18 та 0. Однак ZT 12, 17, 3 або 4 схема подачі викликала різкий фазовий зсув. Периферійні години до фази, подібної до тієї, що спостерігається у схемі годування ZT 0, 6 і 12.

По-третє, ми розділили обсяг їжі, поданої на ZT 4, на половину обсягу, поданої на ZT 0 і ZT 4, щоб скасувати фазові наслідки пізньої вечері. Проаналізувавши периферійні години згідно з графіком годування ZT 12, 17 і 4, ми змінили режим годування тих самих мишей на графік годування ZT 12, 17, 0 та 4. Через два тижні після зміни на новий графік периферичні годинники були трохи зміщені назад для нирок і печінки і значно змістилися назад для підщелепної залози порівняно з попереднім графіком годування, тобто ZT 12, 17 і 4. Це означає, що десятий до пізнього вечора може захистити від фазового зсуву периферійний годинник.

обговорення

У цьому дослідженні ми дослідили функцію in vivo периферійних годин у мишей, які піддавалися багаторазовому режиму годування, призначеному для імітації харчових звичок людини. По-перше, ми виявили, що периферійний годинник є розвиненою фазою після зменшення споживання їжі (рис. 1), а по-друге, що харчовий сигнал, отриманий після тривалого голодування, є сильним фактором у визначенні фази периферійного годинника (рис. 2 та 3).

Мендоса та ін. Раніше 25 показали, що зменшення загального споживання їжі, включаючи 6 прийомів їжі на день, спричинило фазовий зсув не тільки ритмів рухової активності, але також і закономірностей експресії генів годинника в SCN. Цей послідовний фазовий ефект у SCN може бути відповідальним за зміни фазових периферичних годинників, що спостерігаються в цьому дослідженні (рис. 1). Ми також виявили, що обмеження калорій по-різному впливає на прогрес в різних органах. Нирки демонстрували сильнішу реакцію, ніж інші тканини, що підлягали моніторингу (малюнки 1D, 2 та 3). Механізм, що лежить в основі цієї фази обмеження калорій, досі невідомий. Одна з можливостей полягає в тому, що залежні від глюкози зміни активності AMPK можуть змінити період 9 периферичного годинника, і що активність AMPK може бути специфічною для тканини. Однак, оскільки існує багато сигнальних шляхів, задіяних у захопленні периферійних годинників 3, необхідні подальші дослідження щодо ефектів стимуляції їжею в різних органах.

На фази периферійного годинника не впливали різні частоти годування (2, 3, 4 і 6 прийомів їжі на день), коли годування проводилося з однаковими інтервалами, тоді як чіткі зміни фаз спостерігалися, коли 3 прийоми їжі подавались з неоднаковими інтервалами на день (рисунок) . 2 і 3). Цей результат можна пояснити врахуванням тривалості інтервалу між точками часу годування в кожному стані годування. Харчування, яке забезпечується після тривалого періоду голодування (позначеного стрілками на малюнку 3), особливо сильне при перезавантаженні периферійних годин. Раніше ми продемонстрували подібні результати щодо печінки PER2: ритм LUC при харчуванні 2 рази на день, як оцінювали ex vivo за допомогою тканинної культури 22; Зрозуміло, що ефект від інтервалу прийому їжі сильний навіть у мишей, яких годують трьома прийомами їжі протягом звичайного циклу світло-темно.

На закінчення, інтеграція сигналів з декількох режимів дозування визначає один щоденний пік ритмів експресії генів периферичного годинника in vivo. Ця адаптація периферійних годинників залежить від кількості їжі та інтервалу між часом годування, навіть при нормальному циклі світло-темно. Отже, наші результати свідчать про те, що харчові звички людей у ​​сучасному суспільстві змінилися, викликаючи нерегулярні фази периферійних годин. Однак наші результати також свідчать про те, що нерегулярні периферійні годинники можна легко змінити, регулюючи харчові звички.

методи

Усі тварини були виведені та використані з дозволу Комітету з експериментів на тваринах на факультеті науки і техніки університету Васеда (дозвіл 2011-A49) та відповідно до Закону (№ 105) та Повідомлення (№ 6) Японський уряд. Ці дослідження були схвалені Школою науки і техніки при Університеті Васеда.

Гомозиготних мишей PER2: LUC, що вбиваються, зі змішаним фоном C57/BL6J та ICR (альбіноси), повторно схрещували більше 5 разів мишами PER2: LUC C57/BL6J 35 (миші C57/BL6J люб'язно надано доктором Джозефом Такахасі, Північно-Західний університет, Еванстон, Іллінойс, США) та миші ICR (Tokyo Laboratory Animals). Мишей підтримували в режимі світло-темний цикл (12-годинне світло і 12-годинне затемнення, при включеному освітленні о 8:00), при кімнатній температурі 23 ° C ± 1 ° C, вологості 60% ± 5% і інтенсивність світла 100 - 150 люкс на рівні клітини. До експериментів вони були забезпечені стандартними продуктами харчування (MF; Oriental Yeast Co. Ltd., Токіо, Японія) та водою ad libitum. У цьому експерименті використовували мишей-самців (вік: 10-12 тижнів), яких утримували індивідуально. Мишей розділили на 3 групи, яким потім піддавали різні режими годування з подальшим моніторингом in vivo периферійних ритмів годинника.

Протокол моніторингу in vivo

Моніторинг in vivo проводився, як описано вище 23. Кінетична система IVIS (Caliper Life Sciences, MA, США та Summit Pharmaceuticals International Corporation, Токіо, Японія) була використана для візуалізації in vivo. Мишей знеболювали ізофлураном (Mylan Inc., Токіо, Японія) та концентрованим киснем (SO-005B, Sanyo Electronic Industries Co. Ltd, Окаяма, Японія) за допомогою системи газової анестезії (XGI-8, Caliper Life Sciences) всередині чорний ящик. Коли мишам знеболювали, їм вводили калійну сіль D-люциферину (Promega, Madison, WI, USA) sc на спині, біля шиї, у дозі 15 мг/кг (30 мг/10 мл, 0,05). мл/10 г маси тіла). Потім знімки робили через 6 хвилин і 8 хвилин після ін’єкції люциферину в спинне положення нирок та через 10 хвилин та 12 хвилин після ін’єкції у вентральне положення для печінки та підщелепної залози; зображення були зроблені з використанням часу експозиції 1 хв. Дані через 6 хвилин та 12 хвилин отримували як резервні дані для даних, отриманих через 8 та 10 хвилин. Потім для кожного часового моменту біолюмінесцентне зображення об’єднували із зображенням сірої шкали.

Зображення отримували 6 разів на день (ZT 11, 15, 19, 23, 3 та 7). Миші поверталися до своїх домашніх клітин після кожної процедури візуалізації і швидко одужували після анестезії ізофлураном. Загальний час анестезії ізофлураном становив приблизно 20 хвилин на експеримент. Чотиригодинний аналіз анестезії та біолюмінесценції на день не впливав на активність люциферази в периферичній тканині або поведінку 23 .

Аналіз даних моніторингу in vivo

Дані моніторингу in vivo аналізували, як описано раніше 23. Біолюмінесценцію, що випромінюється з кожного органу (нирки, печінка та підщелепна залоза), розраховували автоматично за допомогою програмного забезпечення Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences). Для кожного органу область інтересу (ROI) встановлювалася однаковою за формою та розміром під час усіх експериментів. Для нирок дані правої та лівої нирок розраховували до аналізу. Середнє значення фотонів/с даних з 6 часових точок на кожен день було позначено як 100%, а біолюмінесцентний ритм на весь день виражався у відсотках від кожного набору з 6 часових точок для кожного органу. Пікову фазу та амплітуду цих нормованих% даних визначали за допомогою простої програми процедури косинорів (Acro.exe, версія 3.5; розроблена доктором Рефінетті 36).

Протокол планового годування

У випадку запланованого експерименту з годуванням, усіх мишей утримували окремо в окремих клітинах, що містять дозатори їжі (Гранулятор для гранул 45 мг; Med-Associates, Сент-Олбанс, штат Вірджинія) для доставки харчових гранул (45 мг, очищена дієта для гризунів, BIO- SERV). ), як регулюється таймером 22; кожна з цих страв мала однаковий обсяг їжі.

Мишей розділили на 3 групи і годували 20%, 25% або 40%, обмежуючи кількість їжі, споживаної мишами, що годуються вільно: 20%, 3, 24 г або 72 гранули; 25%, 2,7 г або 60 гранул; і 40%, 2, 43 г або 54 гранули на день. При обмеженні в 20% їжі, при 6-разовому прийомі їжі, миші їли принаймні 3 хвилини в кожен момент часу через 1 тиждень після годування; це було визначено за допомогою відеоспостереження представницької миші. Дані, подані на малюнку 1, стосуються результатів, отриманих, коли мишей годували 6 разів на день, при ZT 0, 4, 8, 12, 16 і 20. У подальших експериментах ми використовували обмеження їжі на 20% на день. Для імітації харчових звичок людини на сніданок у ZT 12 було запропоновано 0,9 г (27% від загального добового обсягу їжі). У ZT 17 ми забезпечували 1,2 г (36%) їжі на обід, а в ZT 1, 3 або 4 на вечерю (малюнки 3B і C). У всіх експериментах периферичні годинники контролювали лише через 2 тижні після початку кожного стану годування.

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середні значення ± SEM. Для статистичного аналізу використовували односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA), тест Тукі-Крамера або неспарені або парні t-тести Стьюдента. Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення StatView (Windows версія 5.0, SAS Institute).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.