- Предмети
- Резюме
- Вступ
- Результати
- Обговорення
- Методи
- підготовка зразка
- Налаштування лабораторії
- Обробка даних (налаштування лабораторії)
- Конфігурація ID19 (ESRF)
- Обробка даних (ID19)
- Додаткова інформація
- Файли PDF
- Додаткова інформація
- Відео
- Додаткове відео 1
- Додаткове відео 2
- Коментарі
Предмети
Резюме
Вступ
Тут ми представляємо фазово-контрастну томографію на основі розповсюдження в оптимізованій комбінації лабораторного джерела струменя рідкого металу 20, приладів, підготовки зразків та алгоритму реконструкції, щоб зобразити великі обсяги тканини мозку миші. Ми можемо показати, що можна досягти високої контрастності в межах реконструйованого об’єму без маркування і що в межах області, що цікавить (ROI), можна візуалізувати окремі нейрони. Це дає доступ до цілої 3D цитоархітектури мозку.
У нашій новій техніці підготовки зразків ми поміщаємо тканину в ксилол після зневоднення в етанолі, подібно до звичайних протоколів для вбудовування у парафін. Як важливий та новий крок, ми опускаємо будь-які додаткові процедури включення або контрастування та вимірюємо зразок після випаровування органічного розчинника. На відміну від фарбування елементами з високим вмістом Z, цей метод, який ми називаємо препаратом EOS (випаровування органічного розчинника), істотно знижує абсорбцію за рахунок видалення води та ліпідів, створюючи при цьому новий контраст між білковою матрицею. Тканиною та навколишнім повітрям.
Реконструкція починається з відновлення фази проекційних зображень, записаних для кожного кута θ томографічного сканування. Для об'єктів з повільно змінюваним поглинанням на малих відстанях розповсюдження z за об'єктом розподіл інтенсивності можна виразити наближеною формою рівняння перенесення інтенсивності 21
де I 0, θ ( р ⊥) та ϕ θ ( р ⊥) позначають інтенсивність і розподіл фаз безпосередньо за об’єктом і
де він був замінений α γ-залежним параметром регуляризації. Ми виявили, що такий підхід до реконструкції, запропонований Witte та співавт. і відомий як корекція за допомогою Броннікова (BAC) 22, він пропонує чудові результати для сучасних незабарвлених тканин та використовуваної конфігурації КТ мікрофокусу 23. Тому він використовується як алгоритм за замовчуванням у цій роботі (рис. 1г, д). Після застосування алгоритму відновлення фази в кожній проекції томографічного сканування проводиться 3D-реконструкція з відфільтрованою задньою проекцією (конусний промінь) 24. Зауважимо, що контраст реконструйованого об’єкта слід розглядати як ефективну величину, по-перше, оскільки як поглинання, так і фазова взаємодія сприяють його значенням, по-друге, оскільки з причин потоку КТ лабораторії, як правило, використовує широкосмугове випромінювання на відміну від синхротронної КТ.
Повнорозмірне зображення
Ми демонструємо можливості лабораторних обставин, зображуючи різні області, що цікавлять мозок миші дикого типу.
Результати
Поєднання режимів візуалізації конусного пучка та зворотної геометрії (до) Об'ємне зображення правої півкулі мозку миші, записане в геометрії конусного променя. Сірі площини вказують положення зрізів, показаних у ( b, c ). (b, c) Корональний/горизонтальний розріз через реконструйований об’єм. (d) Реконструйований корональний зріз області гіпокампа з клітинною роздільною здатністю, записаний у зворотній геометрії. Положення вимірювання з високою роздільною здатністю щодо загального обсягу зразка вказано в ( b ). До томографічної реконструкції індивідуальні види ресемплировались у 2 рази. (і) Проекція максимальної інтенсивності з 31 послідовних зрізів, імітуючи гістологічний зріз товщиною 30 мкм. (F) Реконструйований горизонтальний зріз кортикальної області. (g) Проекція максимальної інтенсивності - 31 зріз. Чітко видно такі помітні коркові особливості, як поле бочки. Смуги шкали: ( b, c ) 500 мкм, ( d - g ) 200 мкм.
Повнорозмірне зображення
Обсяг, що опускається до клітинного рівня мозочка мозочка миші (до) Поперечний переріз реконструйованого об’єму, що показує молекулярний шар (ML), зернистий шар (GL), білу речовину (WM) та клітинний шар Пуркіньє (PCL) верми мозочка в клітинній роздільній здатності. До томографічної реконструкції індивідуальні види ресемплировались у 2 рази. (b) Поздовжній розріз об’єму демонструє достатню контрастність для ідентифікації пучків аксонів у білій речовині. (c) Автоматичне представлення об'єму зразка з фрагментом всередині об'єму, вказуючи положення сегментації клітини, показане в ( d ). (d) Сегментація клітин невеликої частини зразка. Стрижні шкали: 200 мкм.
Повнорозмірне зображення
Як орієнтир та для порівняння ми також провели вимірювання подібного зразка на лінії променя ID19 на ESRF у Греноблі (додатковий малюнок S4, таблиця S1 та відео 2). Порівняння реконструйованих об'ємів дозволяє стверджувати, що, незважаючи на меншу яскравість лабораторної установки, а також тривалий час експозиції, вони мають порівнянну якість та роздільну здатність, обидва вони демонструють клітинні деталі в об'ємах мм.
Обговорення
Ця нова форма віртуальної 3D-гістології дозволяє уникнути недоліків класичної гістології, таких як трудомістка та інвазивна підготовка зразків або механічні спотворення внаслідок процедури різання, а також забезпечує віртуальні гістологічні зрізи в будь-якій бажаній орієнтації та товщині. Найголовніше, що структурний аналіз може виконуватися в 3D замість 2D, що дозволяє вирішувати проблеми нейронних зв’язків та кількісний геометричний аналіз.
Класичне гістологічне фарбування серійних зрізів досі складає основу для аналізу структури мозку у великій кількості досліджень, що стосуються фенотипування мутантних мишей або експериментально індукованих патологічних змін на моделях гризунів на захворюваннях головного мозку. У порівнянні з 3D-оптичними методами, наш підхід пропонує переваги з огляду на високу пропускну здатність, оскільки він не вимагає фарбування або маркування клітин, що займає багато часу для підготовки зразків. Крім того, обмежуючий коефіцієнт відносно тривалого часу сканування в нашому поточному протоколі, швидше за все, буде подоланий у майбутньому, оскільки гарне відношення сигнал/шум вже може бути досягнуте за коротший час експозиції (див. Очікується, що технологія рідкого струменевого анода суттєво збільшить яскравість джерела. Крім того, якщо доступний час променя, можна проводити експерименти на синхротроні, дозволяючи швидкі зображення зразків з трохи вищою контрастністю та роздільною здатністю.
Зверніть увагу, що спосіб досягнення високої роздільної здатності та контрастності передбачає, що як щодо підготовки тканин, так і до основної фізики, можна розробити протоколи для вивчення 3D-архітектури цито- та клітковини в мозку людини. Низька абсорбція препарату значно полегшує вимірювання великих зразків.
Можливість досягнення високої роздільної здатності та контрасту з лабораторними джерелами робить наш метод застосовним до широкого кола біомедичних досліджень, які вимагають більшої доступності та ефективності.
Методи
підготовка зразка
Під час розробки протоколу мозок, який не використовувався для експериментів на КТ, іноді зберігався на кілька тижнів у етанолі. Ми не помітили жодної зміни у поведінці сушіння та макроскопічній морфології. Деякі з цих мозків були регідратовані (додатковий малюнок S6). Час регідратації може залежати від часу зберігання у різних розчинах та у сухому стані. Це систематично не перевірялося.
Жодних змін у грубому або контрастному вигляді не спостерігалося, коли цілий мозок сушили порівняно з меншими частинами мозку. Приготування невеликих розмірів зразків, придатних для кріплення на тримачах предметів КТ, було простішим, коли зразки готували до сушіння. Ми також зазначаємо, що вся процедура застосовується до великих зразків (наприклад, до цілих тіл мишей як найбільшої випробуваної проби). Випаровування ксилолу спричинило скорочення тканини, але не змінило загальну морфологію (додатковий малюнок S6).
Налаштування лабораторії
Ескіз загальної лабораторної установки наведено на рис. 1. Джерело струменя рідкого металу (Excillum, Стокгольм, Швеція) складається з Галинстану (68,5% Ga, 21,5% In і 10% Sn) з характерною енергією фотонів 9,25 кеВ (Ga-K α). Для експериментів він працював при напрузі в трубці 40 кВ, а електрони фокусувались до розміру 10 × 40 мкм 2, в результаті чого отримали приблизний розмір фокусної плями 10 × 10 мкм 2. Зразок поміщають у башту зразків із трьома поступальними осями та однією поворотною віссю для томографічних вимірювань. Крім того, два переходи, паралельні та перпендикулярні проміню, дозволяють розташувати вісь обертання відносно оптичної осі. Для вирівнювання кута нахилу та нульового положення осі обертання детектор розміщений на платформі з двома переходами, перпендикулярними оптичній осі.
У зворотній геометрії в установку була введена камера на основі сцинтилятора XSight (Ригаку, Токіо, Японія). Він складається з тонкого монокристалічного сцинтилятора, 10-кратного об'єктива збільшення та чіпа CCD CCD 2504 × 3326 пікселів з отриманим розміром пікселів 0,54 мкм. Для експериментів з геометрією конусного пучка було встановлено плоскопанельний CMOS-детектор із сцинтиляційним екраном GdOS: Tb (PerkinElmer, Waltham, USA). Він складається з 1536 × 1944 пікселів із розміром пікселів 74,8 мкм. Геометричні та експериментальні параметри вимірювань наведені у додатковій вкладці. S2
Обробка даних (налаштування лабораторії)
Фазове відновлення проводили за алгоритмом BAC для всіх записаних проекцій з використанням параметрів, перелічених у Додатковій таблиці S2. Перед реконструкцією обсягу 3D до синограм 29 застосовували алгоритм вилучення кільцевого методу на основі вейвлетів. 3D-реконструкцію обсягу було отримано за допомогою програмного забезпечення для реконструкції UltraFast ConeBeam (алгоритми Броннікова, Арнем, Нідерланди). Візуалізацію даних проводили за допомогою Avizo (FEI Visualization Sciences Group, Берлінгтон, США). Код рожевого кольору був обраний таким чином, що віртуальні зрізи нагадують гістологічні зрізи, пофарбовані гематоксиліном та еозином (фарбування H&E). Сегментацію окремих клітин пуркіньє проводили вручну для невеликої частини набору даних, тоді як напівавтоматизований підхід використовували для маркування клітин у молекулярному та зернистому шарі. Тут комірки були позначені інструментом пензля на основі порогу, який у межах області, обраної користувачем вручну, позначає лише пікселі із сірим значенням у певному діапазоні.
Конфігурація ID19 (ESRF)
Експерименти проводились на лінії балки ID19 (ESRF, Гренобль, Франція) з паралельною геометрією балки. Зразок розміщується приблизно на 145 м позаду гофроруха у башті з зразками з трьома осями переміщення та однією віссю обертання, тоді як положення осі обертання можна регулювати двома додатковими перенесеннями. Енергія установки є змінною, і для цього експерименту обрано 18,685 кеВ з потоком