Текст завершено

(1) БІОХІМІЧНИЙ І ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ УНІВЕРСІДАД НАЦІОНАЛЬНИЙ ДЕ РОСАРІО. Інститут молекулярної та клітинної біології Росаріо. Докторська дисертація з біологічних наук. Вибіркове розпізнавання датчика/оператора в одновалентних регуляторах реакції металу в Salmonella enterica. Представник: ліцензія Марія Вікторія Гумберт Режисер: д-р Фернандо С. Сончіні. Росаріо, Аргентина 2014.

розпізнавання

(2) 1. Селективне розпізнавання датчика/оператора в одновалентних регуляторах реакції металу у Salmonella enterica. Марія Вікторія Гумберт Диплом біотехнологічного факультету Біохімічних та фармацевтичних наук Національний університет Росаріо. Ця дипломна робота представлена ​​як частина вимог щодо здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук Національного університету Росаріо і раніше не представлялася для отримання іншого ступеня в тому чи іншому університеті. Він містить результати, отримані в результаті досліджень, проведених в Інституті молекулярної та клітинної біології Росаріо (IBR-CONICET), область Молекулярна біологія патогенних мікроорганізмів, залежно від факультету біохімічних та фармацевтичних наук, протягом періоду між 04 червня 2009 р. та 27 березня 2014 р. під керівництвом доктора Фернандо С. Сончіні.

(3) 2. Моїй родині та друзям.

(6) Індекс. СКОРОЧЕННЯ ІНДЕКСУ. 10. ВСТУП. 13. 1. Рід сальмонел 1.1. Інфекційний цикл сальмонели та виживання в навколишньому середовищі. 14 15. 2. Рід Escherichia. 16. 3. Salmonella enterica та Escherichia coli як моделі дослідження. 17. 4. Регулятори транскрипції. 18. 4.1. Сімейство транскрипційних регуляторів MerR. 18. 4.2. Структура регуляторів сімейства MerR. 19. 4.2.1 Домен HTH: спільний знаменник у транскрипційних регуляторах 4.3. Регулятори MerR та їх взаємодія з ДНК. 20 23. 4.3.1 Типові регулятори MerR: класична парадигма транскрипційного регулювання 4.3.2 Нетрадиційні регулятори MerR. 23 26. 4.3.2.1 Регулятори CarA/CarS. 28. 4.3.2.2 Регулятори LitR. 31. 4.3.2.3 Регулятори MlrA. 32. 4.3.2.4 Регулятори BluR. 37. 4.3.2.5 Регулятори Hsp_2. 37. 5. Метали: необхідні, несуттєві та токсичні. 38. 5.1. Класифікація металів. 38. 5.2. Стратегії гомеостазу/стійкість до перехідних металів. 39. 6. Мідний гомеостаз 6.1. 6.2. Гомеостаз міді при кишковій паличці. 40 41. 6.1.1 Регуляр кий. 42. 6.1.2 Регулон. 43. 6.1.3 Альтернативна система стійкості до міді PcoABCD. 44. Гомеостаз міді при сальмонелі 6.2.1 Регулон кий. 45 45. 5.

(10) Індекс. 2.1. Високий рівень STM1266 знижує моторику. 149. 2.2. Надмірна експресія STM1266 стимулює утворення біоплівки. 150. 2.3. Індукція STM1266 збільшує вироблення та секрецію. 2.4. целюлози. 152. Високий рівень STM1266 надає стійкості до стрептоміцину. 153. 3. STM1266 та його значення у регулюванні формування біоплівки. 155. Дискусія. 158. 1. Порівняльний аналіз транскрипційної регуляції csgD у E. coli та S. enterica. 159. 2. Білки з доменами GGDEF: позитивна регуляція csgD. 164. 3. Білки з доменами EAL: негативна регуляція csgD. 166. ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ. 168. РЕЗЮМЕ. 174. БІБЛІОГРАФІЧНА ЛІТЕРАТУРА. 176. 9.

(11) Скорочення. Скорочення А. Підсилювачі. Абс. Поглинання ДНК. Дезоксирибонуклеїнова кислота. AHL. N-ацил-гомосерин-лактон. Підсилювач Ампіцилін. РНК. Рибонуклеїнова кислота. ARNPol. РНК-полімераза. АТФ. Аденозин 5 'трифосфат. BCIP. 5-бром, 4-хлор, 3-індофосфат. BSA. Бичачий сироватковий альбумін. Кбл. Кобаламін. c-di-GMP. біс- (3 '; 5') -гуанозинциклічний монофосфат. Пор. Кінцева концентрація. Ci. Кюрі. CIM. Мінімальна інгібуюча концентрація. См. Левоміцетин. С-термінал. Карбоксил-термінал. DGC. Дигуанілатциклаза. ДНаза I. Дезоксирибонуклеаза I. DTT. Дітіотреїтол. ЄС. Кишкова паличка. EGTA. Етиленгліколь біс (β-аміноетиловий ефір) N, N, N ', N'-тетраоцтова кислота. EMSA. Тест на затримку електрофоретичної рухливості. Стреп. Стрептоміцин. Fw. Прямий. 10.

(12) Скорочення g. Грам. г/л. Грам на літр. ВЕРХ. Рідка хроматографія високого тиску. HTH. Спіраль-поворот-спіраль. IPTG. Ізопропіл β-D-тіогалактопіранозид. кА. Постійна рівноваги (асоціація). кб. Кілобаза. кД. Постійна рівноваги (дисоціація). Км. Канаміцин. ФУНТ. Лурія Бертані. Примітка. Поживний бульйон. NBT. Нітротетразолій синій. nt. Нуклеотид N-термінал. Аміно-термінал. ONPG. О-нітрофеніл-галактопіранозид. ORF. Відкрита рамка для читання. стор. Плазмідна. П. Промоутер. pb. Пари основ. ПЛР. Ланцюгова реакція полімерази. PDE. Фосфодіестераза. (p) ppGpp. Гуанозин пентафосфат. п/в. Вага в об’ємі. р. Анізотропія флуоресценції. А. Стійкий. ЯМР. Ядерний магнітний резонанс. об/хв. Обертів за хвилину. одинадцять.

(13) Скорочення Rv. Назад. SDS. Додецилсульфат натрію. СН. Супернатант. STM. Salmonella Typhimurium. Tc. Тетрациклін. У. одиниця. або. а . Довільні одиниці. У. М . Одиниці Міллера. UFC. Колонієутворюючі одиниці. УФ. Ультрафіолет. В. Вольт. Vf. Остаточний обсяг. v/v. Обсяг за обсягом. ЩО. Спіраль-поворотно-крилата спіраль. Х-гал. 5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-D-галактопіранозид. α. Спіраль-α. β. Аркуш-β. Δ. Видалення 12.

(25) Вступ. (Желєзнова Гельдвейн і Бреннан, 2001). Взаємодія регулятора з його коактиватором суттєво не впливає на його спорідненість до ДНК. Натомість це спричиняє конформаційну зміну, яка передається внутрішньомолекулярно до ДНК-зв'язуючого домену і в кінцевому підсумку призводить до розслаблення кривизни та розмотування ДНК в операторній послідовності, що призводить до перебудови ящиків -35 та -10, формування комплексу, відкритого RNAPol, і подальше ініціювання транскрипції (рис. 5) (Ansari et al., 1992, Outten et al., 1999; Zheleznova Heldwein and Brennan, 2001; Newberry and Brennan, 2004). розмотування ДНК бере свій початок у послабленні водневих зв’язків пари основ АТ, яке зазвичай знаходиться в центрі симетричної діади оператора, дозволяючи спотворення в центрі. Цей базовий зсув стабілізувався б взаємодією між залишками білка та фосфатним кістяком ДНК. Оскільки ідентичність центральної пари основ паліндромної послідовності зберігається як аденин або тимін у більшості промоторів MerR і додається до того, що вони не впливають на спорідненість регулятора. 24.

(27) Вступ. 4.3.2 Нетрадиційні регулятори MerR Недавні дослідження в більш різнорідних представників цього сімейства, таких як CarA, LitR, MlrA, BluR та HspR_2, показують механізми взаємодії з ДНК, які відрізняються від уніфікованої моделі дії, згаданої в попередньому розділі. . У цій нещодавно охарактеризованій підгрупі регуляторів регулятор може виступати або як активатор, або як репресор їх генів-мішеней. Модель дії також включатиме участь інших регуляторних білків, які змагатимуться за взаємодію регулятора типу MerR для ДНК або перешкоджатимуть його взаємодії з операторською послідовністю, приєднуючись безпосередньо до ДНК-зв'язуючого домену за допомогою взаємодії білка. -протеїн, і таким чином витісняє регулятор MerR зі своєї цільової ділянки. Крім того, порівняльний аналіз послідовностей цільових операторів, розпізнаних атиповими регуляторами MerR (Рис. 7-B), виявляє суттєві відмінності від тих, які визнані характерними операторами цього сімейства, анулюючи можливість встановлення загальних правил, що описують загальний структурний та функціональний механізм серед усіх регуляторів транскрипції MerR.

(28) Вступ. У приватному випадку операторів, розпізнаних нетрадиційними регуляторами MerR, симетрична діада розташована на відстані від ящиків -35 та -10, зазвичай накладених на ящик -35, або вище за течією (рис. 7-Б). Ця структурна характеристика, незвична для більшості операторів MerR (рис. 7-А), вказує на те, що модель механістичного регулювання, як правило, репресія, буде відрізнятися від запропонованої для звичайних або типових регуляторів типу MerR. У нетрадиційних регуляторах це не залежатиме від конформаційної реконфігурації оператора та перестановки блоків -35 та -10, опосередкованих регулятором, що передбачає дві різні моделі регулювання в цьому сімействі регуляторів. 27.

(29) Вступ. Філогенетично споріднені та структурно аналогічні, особливо на рівні N-кінцевого ДНК-зв'язуючого домену (рис. 8) 4.3.2.1 Регулятори CarA/CarS У групі атипових регуляторів транскрипції MerR виділяють регулятори типу CarA/LitR, які містять у своєму С-кінцевому домені мотив зв’язування з кобаламіном (вітамін В12). Вони беруть участь у модульованій світлом транскрипційній регуляції у багатьох різноманітних нефототрофних бактеріях (актинобактерії та грамнегативні бактерії, такі як Pseudomonas, Shewanella та Vibrio). Інгібування фотоокислювального стресу через вироблення каротиноїдів, жовтих, помаранчевих або червоних пігментів, що захищають клітину від пошкоджень, спричинених вільними радикалами кисню, є високоохарактеризованою фотозалежною фізіологічною характеристикою багатьох нефототрофних бактерій. Важлива група видів бактерій накопичує цей клас пігментів при їх освітленні. Це свідчить про еволюційне збереження певної регуляторної системи, яка перетворює світловий сигнал на експресію генів, необхідних для біосинтезу каротиноїдів. Деталі цих систем регулювання досі невідомі.

(35) Вступ. Непрямий біосинтез целюлози шляхом транскрипційної активації AdrA. Цей білок має дігуанілатциклазну активність, саме тому він здатний стимулювати вироблення циклічного біс- (3 ', 5') -гуанозинмонофосфату (c-di-GMP), всюдисущої бактеріальної сигнальної молекули. Потім цей метаболіт виступає важливим вторинним носієм для біосинтезу целюлози та, можливо, інших екзополісахаридів (рис. 12-А). Регуляція CsgD вважається ключовою при прийнятті рішень між планктонною формою життя та утворенням біоплівки. MlrA - не єдиний фактор, який бере участь у регуляції транскрипції csgD, але існують інші регулятори, які модулюють експресію csgD в дуже різних індукуючих умовах: під час стаціонарної фази росту через брак поживних речовин, при мікроаеробіозі, при аеробіозі в мінімальному середовищі, при лужному pH (pH 8,5), низькій осмолярності та температурі (28 ºC). Ось чому промотор csgD визнаний одним із найскладніших промоторів E. coli (Gerstel et al., 2003; Ogasawara et al., 2010; Ogasawara et al., 2011). Послідовність зв'язування MlrA в області промотору csgD (рис. 7-B) складається з 11 bp інвертованого повтору з інтервалом 12 bp (MlrA-box), і вона є. 3. 4.