Був використаний польовий штам Mycobacterium avium paratuberculosis, переданий доктором Марко Антоніо Сантілланом з CENID Microbiology INIFAP, цей штам був використаний як позитивний контроль в аналізі ПЛР.
Наприкінці 2008 року у коз віком від 1 до 3,5 років у громаді Ла-Месіла, що в муніципалітеті Текозаутла, було зібрано 139 зразків калу та крові. Цей муніципалітет розташований у штаті Ідальго, між паралелями 20 ° 48 'широти, -99 ° 67' довготи, на висоті 1890 метрів над рівнем моря. У цьому районі є виробники сільського типу з виробництвами з низьким рівнем техніки з невеликою кількістю профілактичних практик медицини, а виробництво кіз велике. Вони працювали з 8 різними стадами, всі підозрювані на Карті. Кал поміщали в мішки, а зразки крові - у вакуумні пробірки без антикоагулянта. Після збору зразки поміщали в термос з льодом для їх консервації та подальшого аналізу в лабораторії сільськогосподарської мікробіології Університету Автономії Метрополітана Xochimilco.
Пляма Зіль-Нельсена (ZN)
Всі зразки стільця аналізували за допомогою спеціальної кислотно-спиртостійкої плями (17), яка в основному виявляє наявність кислото-спиртостійких паличок, сумісних з Map.
Вилучення ДНК із зразків калу
Вкладена ПЛР для виявлення карти
Для першого посилення використовували зовнішні праймери IS 900-F (5 'TGATCTGGA CAATGACGGTTACGGA 3') та IS 900-R (5 'CGCGGCACGGCTCTTGTT 3'), які посилюють продукт 563 bp (18). Реакція ПЛР містила: 45 мкл суміші ПЛР (22 мМ Трис-HCl рН 8,4, 1,65 мМ MgCl 2, 220 мкм dGTP, 220 dATP, 220 мкМ dCTP, 220 мкМ dTTP, 2 ОД Taq полімерази (Промега) 300 мкг першої IS900-F, 300 мкг першого IS900-R та 2 мкл зразка ДНК. Умовами циклів ПЛР були: початкова денатурація 94 ° C протягом 3 хвилин, потім 35 циклів 94 ° C протягом 1 хвилини, 56 ° C протягом 1 хвилини та 72 ° C протягом 1 хвилини. Для другої ампліфікації (вкладена ПЛР) було взято 5 мкл ампліфікованого продукту та додано до нової реакції ПЛР, тепер із внутрішніми праймерами IS 900 -IF (5 'GCCGCGCTGCTGGAGTTGA 3 ') та IS 900-IR (5' AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG 3 '), які генерують продукт на 210 п.н., умови цього циклу ПЛР були однаковими. Продукти, отримані в результаті цього другого посилення, візуалізували електрофорезом на 1% агарозних гелях, забарвлених в броміді етидію (18).
Використовували лише сироватки від тварин, що належать до стада, з позитивними посиленнями для карти. Для виконання методики була використана комерційна система «Паратуберкульозний скринінг Ab Kit» (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) (19), яка відповідає вимогам виробника.
Вилучення ДНК із зразків калу
Процедуру вилучення та візуалізації ДНК проводили на 139 зразках. З цих зразків лише 54 мали чітку присутність ДНК. На (рис. 1) спостерігається ДНК, витягнута з деяких зразків, як видно на цьому малюнку, отримана ДНК демонструє незначну деградацію, що не вплинуло на розвиток методики ПЛР, це також можна було оцінити в деяких зразках наявність РНК, що є нормальним явищем з урахуванням використовуваного протоколу екстракції.
Пляма Зіль-Нельсена (ZN)
При аналізі зразків за допомогою фарбування ZN 6 із 139 проаналізованих зразків були позитивними щодо фарбування, тобто кислото-спиртостійкі палички, сумісні з картою (рисунок 2, таблиця 1). Для стада А 4 позитивні зразки становлять 20%, тоді як для стада D спостерігали 4% зразків, позитивних до фарбування, і, нарешті, у стаді Н отримали позитивну пробу до фарбування, що становить 8,3% від загального стада.
До використання із зразками методика ПЛР була стандартизована з використанням ДНК із штаму Map. Цю ДНК використовували у всіх аналізах як позитивний контроль. З усіх проаналізованих зразків 7 мали позитивні результати вкладеної ПЛР (рис. 3). Слід зазначити, що ці 7 зразків були зі стада А, що збігалося з трьома позитивними зразками для фарбування ZN та п’ятьма для ІФА (табл. 1). Ці сім зразків становлять 5,03% від загальної кількості зразків; і 35% від загальної кількості зразків із стада 1, де спостерігалася більша частота зразків, позитивних до карти .
Аналіз сироваток за допомогою ІФА
Тільки сироватки з позитивних стад на Карті аналізували за допомогою ПЛР та фарбування ZN, отримані результати наведені в Таблиці 2, де включені негативні та позитивні контрольні значення. За допомогою цих даних було встановлено граничну точку 0,438, як запропоновано Курстаком (20). Враховуючи це значення, зразки A3, A18, A8, A11 та A16 були позитивними. У випадку зразків A11 та A18 результати збігаються з результатами, отриманими в результаті тесту ПЛР.
Паратуберкульоз - це інфекційне захворювання з поширенням у всьому світі, яке негативно впливає на виробництво худоби. У Мексиці ситуація щодо захворюваності на цю хворобу невідома, і повідомлень про дрібних жуйних тварин небагато. У цій роботі про наявність Карти повідомляється у стаді коз в Текозаутла, Ідальго, що є першим звітом Карти в цій області. Раніше Чавес та ін. (8) провели пошук цього мікроорганізму з використанням різних методологій у стаді коз, розташованому в долині Мексики. Ця робота разом із попередньою складає перші повідомлення про карту у коз.
Для визначення присутності інфекційного агента в популяції розроблено різні методології, логічно, перша - ізоляція; однак для багатьох патогенних мікроорганізмів, особливо представників роду Mycobacterium spp., ізоляція є складною і становить ризик, оскільки деякі види цього роду вважаються зоонозними (10,18). У цій роботі використовувались прямі та непрямі методи; у першому випадку було вирішено застосувати молекулярний метод, заснований на техніці ПЛР, який виявляє наявність ДНК у клінічних зразках. Цей метод також має ту перевагу, що, не працюючи безпосередньо з агентом, це безпечний метод. За цією методологією було виявлено сім позитивних зразків із загальної кількості 139. Позитивні зразки були від тварин, що належать до одного стада, де було досліджено 20 зразків. Чавес та ін. (8) працюючи з одним стадом з 27 тварин, вони досягли ізоляції у 4 випадках і зайняли приблизно 14 тижнів; у нашому випадку ідентифікація позитивних тварин вимагала лише двох днів.
Ця робота також представляє новий протокол для вилучення ДНК із зразків стільця, ця процедура використовує гуанідин ізотіоціанат і дозволяє ефективно екстрагувати нуклеїнові кислоти. Цей метод раніше не застосовувався, оскільки в ряді досліджень, де фекалії використовуються як зразки, використовуються комерційні системи, які збільшують вартість аналізу (21,22); однак у цьому випадку розроблений метод має низьку вартість.
Безпосереднє спостереження в клінічних зразках мікроорганізмів роду Mycobacterium (мікроскопія мазка) - ще один метод ідентифікації, який використовує здатність цих бактерій утримувати первинне пляма навіть після знебарвлення кислотним спиртом, ситуація, коли стійкі лише кислотно-спиртові (AAR) може показати, виключаючи інші роди бактерій, присутні в калі, такі як негативні або позитивні бацили. Циммер та ін. (23) повідомили у 1999 р., Що фарбувальний тест Зіля-Нельсена має чутливість 49,3% у тварин з клінічними ознаками та 19,3% у субклінічних тварин. На цьому етапі слід пояснити, що той самий тест у гістологічних зрізах послужив остаточно встановити взаємозв'язок Mycobacterium spp. з розвитком гранулематозних уражень в кишечнику.
З іншого боку, Tripathi et al. (16) під час роботи із зразками кишечника кози вдалося встановити 80% кореляцію у зразках кишечника з ураженнями та гістологією, що свідчить про ампліфікацію Map та IS900 в тесті ПЛР. У цій роботі наявність 6 паличок AAR було продемонстровано в 6 зразках калу, враховуючи попередні дані, можна сказати, що ці тварини позитивно ставилися до карти. Подібно до інших досліджень, результати, отримані при мікроскопії мазка, корелюють з результатами, отриманими при ПЛР.
Уіттінгтон та співавт. (24) повідомили, що Mycobacterium avium paratuberculosis неможливо виявити методами ізоляції у тварин віком до двох років, заражених бактеріями, оскільки вони усувають мінімальний рівень Mycobacterium avium paratuberculosis. У зв'язку з цим, у цій роботі було отримано сім позитивних зразків на мікобактерії методом ПЛР у зразках тварин віком до трьох років, встановивши, що ця методика може бути використана у молодих тварин для діагностики паратуберкульозу.
Нарешті, що стосується даних, отриманих в ІФА, за допомогою ПЛР аналізували лише позитивне стадо; у цьому стаді захворюваність на паратуберкульоз становила 25%. Однак були тварини, розташовані дуже близько до точки відсічення (20), які були негативними в цій роботі, тому значення захворюваності могло бути вищим. У зв’язку з цим, хоча серологічний тест ІФА має вищу чутливість, важливо пояснити, що існують також різні фактори, які впливають на нього, такі як стан тварини. Трипаті та ін. (16) досліджували заражених тварин за допомогою ПЛР та ІФА, і виявили, що в деяких випадках високих титрів не було, деякі навіть були негативними, що збігається з результатами, видною з цієї роботи.
Присутність Mycobacterium avium paratuberculosis було продемонстровано за допомогою діагностичного тесту ПЛР, заснованого на виявленні послідовності вставки IS900, фарбування ZN та ІФА у стаді коз в Текозаутла, Ідальго. Необхідно проводити більше досліджень у різних районах Мексики, щоб виключити або підтвердити наявність Карти, оскільки недостатньо інформації щодо Карти у кіз.
1. Харріс Н.Б., Барлетта Р.Г. Mycobacterium avium subsp. паратуберкульоз у ветеринарній медицині. Clin Microbiol Rev. 2001; 14 (3): 489-512.
2. Вільяріно М.А., Скотт Х.М., Йорданія ER. Вплив паритету під час виявлення серологічних антитіл до підвиду паратуберкульозу Mycobacterium avium на зменшення щоденного та прижиттєвого виробництва молока у голштинських корів. J Anim Sci.2011; 89: 267-276.
3. Вейганд П. В., etете Р. Патогенез інфекцій підвиду паратуберкульозу Mycobacterium avium у жуйних: все ще більше питань, ніж відповідей. Мікроб заражений. 1999; 1 (13): 1121-1127.
4. Carslake D, Grant W, Green Laura E, Cave J, Greaves J, Keeling M, et al. Ендемічні хвороби великої рогатої худоби: порівняльна епідеміологія та управління. Phil Trans R Soc B. 2011; 366: 1975-1986.
5. Фіорентино М.А., Джофре А, Цироне К, Морселла С, Алонсо Б, Дельгадо Ф та ін. Перше виділення Mycobacterium avium subsp. паратуберкульоз у молочної кози в Аргентині: патологія та молекулярна характеристика. Small Rum Res.2012; 108 (1-3): 133-136.
6. Махешварі А, Фахруддін Ф, Танвар Р.К., Чахар А, Сінгх А.П. Серопоширеність паратуберкульозу у кіз у Біканера. Ветеринарна практика. 2012; 13 (1): 28-29.
7. Medeiros L, Junior FG, Almeida AP, Lucena EA, Riet-Correa F. Паратуберкульоз у кіз та овець у штаті Парайба. Бразильські ветеринарні дослідження. 2012; 32 (2): 111-115.
8. Чавес Г.Г., Тріго Т.Ф., Свастова П., Павлік І. Ідентифікація генетичного поліморфізму ізолятів Mycobacterium avium paratuberculosis у кіз із центральної Мексики. Vet Mex. 2004; 35 (1): 72-82.
9. Preziuso S, Magi GE, Renzoni G. Виявлення Mycobacterium avium subsp. паратуберкульоз в тканинах кишечника та молочної залози та в лімфатичних вузлах овець за різними методиками та його взаємозв’язок із ураженням кишкової кишки. Small Rum Res.2012; 105: 295-299.
10. Де Хуан ЛАЖ, Ромеро Б, Безос Дж, Кастелланос Е, Араназ А та ін. Порівняння чотирьох різних культурних середовищ для виділення та зростання типів штамів Mycobacterium avium paratuberculosis типу II та I/III типу, виділених із великої рогатої худоби та кіз. Env Microb. 2006; 72 (9): 5927-5932.
11.Hailat N, Fayyad A, Ababneh M, Hananeh W, Rezig FE, Jaradat S. ПЛР-рестрикційний ендонуклеазний аналіз Mycobacterium avium subsp. паратуберкульоз ізолює від кіз, овець та великої рогатої худоби в Йорданії. Комп Клін Патол. 2012; 21 (5): 755-760.
12. Форде Т, Куц С, де Бак Дж, Уоррен А, Рукштуль К, Пібус М та ін. Виникнення, діагностика та штампування підвиду Mycobacterium avium підвид паратуберкульозу у скельних гірських овець (Ovis canadensis canadensis) на південному заході Альберти. J Дикої природи Dis. 2012; 48 (1): 1-11.
13. Діаз Ф.О., Банда В.Р., Харамільо Л.М., Арріага К.Д., Гонсалес Д.С., Естрада С. Ідентифікація бичків, що несуть Mycobacterium bovis, за допомогою імунологічних та молекулярних методів. Vet Mex. 2003; 34 (1): 13-26.
14 Stanley EC, Mole RJ, Smith RJ, Glenn SM, Barer MR, et al. Розробка нового комбінованого швидкого методу з використанням фагів та ПЛР для виявлення та ідентифікації життєздатних бактерій Mycobacterium paratuberculosis протягом 48 годин. Appl Envir Microb. 2007; 73 (6): 1851-1857.
15. Коллінз Д.М., Мей Де Зоет, Кавейнак С.М. Штами Mycobacterium avium paratuberculosis від великої рогатої худоби та овець можна розрізнити за допомогою ПЛР-тесту, заснованого на новій різниці послідовності ДНК. J Clin Microb. 2002; 40 (12): 4760-4762.
16. Tripathi BN, Periasamy S, Paliwal OP, Singh N. Порівняння ПЛР тканини IS900, посівів бактерій, йоніну та серологічних тестів для діагностики природного паратуберкульозу у кіз. Ветеринарний мікроб. 2006; 116: 129-137.
17. візник GR. Діагностичні процедури у ветеринарній бактеріології та мікології. 1984; 4-е видання, видавець Charles C Thomas, США.
18.Erume J, Spergser J, Rosengarten R. Швидке виявлення Mycobacterium avium p аратуберкульозу великої рогатої худоби та тварин зоопарку за допомогою вкладеної ПЛР. African Health Sci.2001; 1 (2): 83-89.
19. Коллінз М.Т., Скотт Дж. В., Петріні К.Р., Коллінз Дже., Шульц Р.Д., Вітлок Р.Х. Оцінка п'яти тестів на виявлення антитіл для діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12 (6): 685-692.
20. Курстак Е. Ферментна імунодіагностика. 1986. Канада, Академічна преса.
21 Wells SJ, Collins MT, Faaberg KS, Wees C, Tavornpanich S, Petrini KR, et al. Оцінка швидкого фекального ПЛР-тесту на виявлення аратуберкульозу Mycobacterium avium p у молочної худоби. Клініка Vac Immunol. 2006; 13 (10): 1125-1130.
22 Stabel JR, Bannantine JP. Розробка методу вкладеної ПЛР, націленого на унікальний багатокопійний елемент, ISMap02, для виявлення паратуберкульозу Mycobacterium avium у фекальних зразках. J Clin Microb. 2005; 43 (9): 4744-4750.
23 Zimmer K, Dräger KG, Klawonn W, Hess RG. Внесок у діагностику хвороби Джонна у великої рогатої худоби. Порівняльні дослідження щодо обґрунтованості фарбування за Цілем-Нельсеном, культури фекалій та комерційно доступного ДНК-зондового тесту для виявлення Mycobacterium paratuberculosis у фекаліях великої рогатої худоби. Zentralbl Vet Med B. 1999; 46 (2): 137-40.
24 Whittington RJ, Ian BM, Vanessa S, Grant IR, Juste R, Sevilla IA, et al. Культура Фенотипи геномно та географічно різноманітних Mycobacterium avium subsp. паратуберкульоз Ізоляти від різних господарів. Клін Мікробіол. 2011; 49 (5): 1822-1830.
Отримано: 4-5-2012.
Прийнято: 1-17-2013.
Весь вміст цього журналу, крім випадків, коли він ідентифікований, підпадає під ліцензію Creative Commons
- Джин-тонік служить для обмеження зони проживання зірок - Фаро-де-Віго
- Едвард; Балі; Букка; Важко бути поза зоною комфорту політики, але бути
- Вплив харчової добавки для прийому всередину гіперпротеїну у пацієнтів з недостатнім харчуванням, розташованих в
- Раннє виявлення невдалих методів лікування хворих на туберкульоз легенів
- Міжнародний день негідників ЗОНА ТРЕТА