використання

  • предметів
  • реферат
  • Головний
  • Матеріали і методи
  • Протокол
  • Оцінка справи та подальші дії
  • імуногістохімія
  • Приготування заморожених деталей
  • результат
  • Клінічні ознаки
  • Периферійна імуногістохімія
  • Група пацієнтів
  • Заморожені зрізи
  • обговорення

предметів

  • Колоніальні хвороби
  • діагностика
  • імуногістохімія

реферат

Головний

Вроджений агангліоноз кишечника або хвороба Гіршпрунга є наслідком вади розвитку ентеральної нервової системи. Адекватна моторика шлунково-кишкового тракту вимагає іннервації належним чином розвиненою і зрілою кишково-кишковою нервовою системою. Відсутність внутрішніх гангліозних клітин з дистальної прямої кишки та змінна довжина сусідньої кишки є бажаною діагностичною особливістю хвороби Гіршпрунга. В ембріологічному розвитку нервові волокна кишечника мігрують каудально з блукаючими волокнами і надходять у товсту кишку протягом 12 тижнів. Десять років тому було виявлено, що втрата функціональних мутацій кількох генів, включаючи губу прото-онкогену ret, бере участь у розвитку агангліозу. 1 Ці мутації "втрати функції", як відомо, впливають не тільки на розвиток і міграцію гангліозних клітин, але також беруть участь у ранній загибелі гангліозних клітин. 2

Дослідження ректальних біоптатів на наявність або відсутність гангліозних клітин проводиться у пацієнтів із підозрою на хворобу Гіршпрунга. У деяких випадках ідентифікація гангліозних клітин може бути утруднена, особливо у популяції з найвищим ризиком розвитку новонародженого з хворобою Гіршпрунга. У цих пацієнтів незрілі клітини гангліїв можна сплутати з ендотеліальними клітинами, іншими мезенхімальними клітинами та клітинами запалення. З цієї причини багато установ використовують гістохімічне фарбування ацетилхолінестеразою на замороженій тканині прямої кишки як доповнення до діагностики агангліонозу. Однак точна діагностика цих плям заморожених скибочок вимагає високого рівня знань, особливо у незрозумілих випадках. 3, 4 Як варіант, виявлення нервової гіпертрофії може бути корисною додатковою діагностичною модальністю у разі агангліонозу. Як повідомляється, 90% біоптатів прямої кишки у пацієнтів із хворобою Гіршпрунга мають підслизові нервові штами діаметром приблизно 40 мкм. 5

В результаті цих діагностичних проблем розвинувся ряд імуногістохімічних плям, які допомагають ідентифікувати клітини гангліїв. Антитіла проти нейроспецифічної енології (NSE), 6, 7, периферичні, 7, 8, 9, 10 катепсин D, 8, 11 bcl-2, 12 NeuN, 13 кістковий морфогенетичний білковий рецептор IA (BMPRIA), 14 нейрофіламенти, 7, 15 тубуліну, 15 онкопротеїнів губ, 16 та нещодавно MAP-2 17 успішно виділили гангліозні клітини, які важко ідентифікувати з фарбуванням гематоксиліном та еозином (H&E).

У 2002 році ми розробили та впровадили протокол із використанням периферичного імуногістохімічного фарбування у поєднанні з оцінкою H&E для ідентифікації гангліозних клітин у біоптатах прямої кишки. Вивчивши літературу, ми вибрали периферичну для посилення гангліозних клітин, оскільки вони показали сильне фарбування гангліозних клітин у тканинах кишечника дорослої та дитячої кишок. Ми помітили, що було незначне імунозабарвлення зернистих нервових волокон; однак ніколи не було важко відрізнити це фарбування від типового щільного цитоплазматичного фарбування окремих кластерів клітин гангліїв. Ми також провели імуногістохімічне фарбування S-100 як доповнення для виявлення нервової гіпертрофії. Ось результати нашого протоколу за останні 7 років.

Матеріали і методи

Протокол

Протокол складається з восьми рівнів H&E, двох периферичних антитіл та двох імуноаналізів S-100. Незабарвлені предметні стекла для імунозабарвлення отримували на рівнях 3, 4 та 8, 9 у блоці. Якщо клітини гангліїв не були ідентифіковані за оригінальним протоколом, було проведено додаткове H&E та периферичне фарбування.

Протягом семирічного періоду 10 патологоанатомів з нашого закладу інтерпретували ці біоптати прямої кишки. Якби в початковому протоколі не було гангліозних клітин, між патологоанатомами, що діагностують, існували відмінності в кількості додаткових рівнів H&E та імунозалежних речовин. Кількість замовлених H & Es коливалась від 10 рівнів до послідовних розділів через блок.

Оцінка справи та подальші дії

Після схвалення Інституційною комісією з огляду всі біопсії, отримані для виключення хвороби Гіршпрунга, були отримані з патологічних архівів Медичного факультету штату Джорджія з 2002 по 2009 рр. Всі випадки діагностували за допомогою протоколу імуногістохімічного фарбування периніну та S-100 . Кожен випадок оцінювали на наявність або відсутність гангліозних клітин та гіпертрофію нервів. Якщо були присутні гангліозні клітини, ми визначали, чи були вони виявлені на початковому протоколі або на повторних рівнях. Якщо клітини гангліїв відсутні, ми оцінювали зразки резекції на наявність або відсутність сегмента Аганглі. Доступне спостереження було отримано за допомогою аналізу графіків пацієнтів. Крім того, було проведено огляд для оцінки пацієнтів, яким зробили заморожені зрізи.

імуногістохімія

Імуногістохімію проводили після депарафінізації ксилолу на ділянках реплікації та за допомогою стандартного комплексу авідин-біотин. Були використані антитіла проти наступних антигенів: периферичні (PJM50 моноклональні; 1: 100; Vector Laboratories, Бурлінгейм, Каліфорнія, США) та S-100 (поліклональні; 1: 6000; Dako Corporation, Carpenteria, CA, USA). Збір антигенів для периферійної імуногістохімії включав нагрівання скороварки з цільовим показником рН 6, 0. Для імуногістохімії S-100 попередня обробка не застосовувалась.

Імунологічне фарбування периферії вважалося позитивним, якщо було виявлено характерне цитоплазматичне фарбування гангліозних клітин у нервовому сплетенні (рис. 1а та b). Максимальний діаметр підслизових нервових волокон оцінювали шляхом імунофарбування за допомогою S-100 за допомогою візуальної мікрометрії. У гангліозитивних випадках дотримувались обережності, щоб не виміряти цибулинне розширення нервових волокон, коли вони протікали по гангліях (рис. 1г).

a ) Типове імунозабарвлення скупчень периферійних гангліозних клітин (× 40). b ) Периферичне фарбування гангліозних клітин із зернистими відкладеннями в нервовому пучку (стрілка) на вході в ганглій (х 100). c ) слабке лінійне та зернисте імунофарбування дрібних нервових пучків у підслизовій оболонці (стрілки) (× 40). ( d ) Негативне фарбування гангліозних клітин у пацієнта без пацієнта Гіршпрунга з імунофарбовою фарбою S-100 (х 100).

Повнорозмірне зображення

Приготування заморожених деталей

Тканини, отримані для заморожених зрізів, розрізали на зрізи по 5 мкм відповідно до стандартного протоколу. Одне предметне скло фіксували у 95% етанолі та фарбували H&E. Другому предметному склу давали висохнути на повітрі та фарбували за стандартним протоколом Diff Quick.

результат

Клінічні ознаки

Для оцінки було відібрано 138 випадків поспіль. Два випадки не були діагностичними через відсутність підслизової тканини, і повторні біопсії не проводились. В інших випадках було 90 чоловіків та 46 жінок. У сто дев'яти пацієнтів були гангліозні клітини, з них 66 чоловіків та 43 жінки. З 27 пацієнтів без гангліозних клітин 23 були чоловіками та 4 жінки, що відповідає переважності хвороби Гіршпрунга у чоловіків.

Вік пацієнтів становив від 2 днів до 55 років. У сорока одного (41%) пацієнта з гангліозними клітинами, присутніми у віці 1, 2, 3 років та на прохання хірургів, повторювались біопсії гангліозних клітин. У додатку та додатку виявлено одного пацієнта з перфорацією сліпої кишки та клітинами гангліїв. Подальша ректальна біопсія була позитивною для клітин гангліїв. Одному пацієнтові зробили дистальну резекцію передсердя з підтвердженням наявності гангліозних клітин у резектованому сегменті. Подальша ректальна біопсія була позитивною для клітин гангліїв.

Імуногістохімічне фарбування S-100 можна оцінити у 107 пацієнтів з гангліозними клітинами (середній діаметр 20 мкм (діапазон 8–55 мкм)). 103 з них заховали пучки нервів

a ) Імунологічне фарбування S-100 підкреслює нервову гіпертрофію у пацієнта з хворобою Гіршпрунга (× 40). ( b ) Збільшення нервових фібрил слизової м’язової оболонки та пластинки, спричинене пацієнтом із хворобою Гіршпрунга при фарбуванні S-100 (× 100). c ) Дифузне фарбування Quik виявляє яскраво-синю цитоплазму гангліозних клітин (x 40). d ) огляд замороженої ділянки з використанням H&E (× 20).

Повнорозмірне зображення

Заморожені зрізи

Аналіз заморожених зрізів проведено 26 пацієнтам. З цих 26, 22 пацієнти мали резекції хвороби Гіршпрунга, у двох повторні біопсії (інтраопераційне підтвердження присутності гангліозних клітин) і у двох біопсія de novo. Протокол Diff Quick забарвив цитоплазму гангліозних клітин у яскраво-синій колір, прискорюючи інтраопераційну оцінку (малюнки 2c та d). У цих пацієнтів було проведено 57 заморожених зрізів, причому 95% (54 з 57) погодились з постійними зрізами. Встановлено, що три викиди є помилками вибірки.

обговорення

Історично склалося так, що оцінка підслизових нервових штамів та нервових штамів мускулатури та власної пластинки мала вирішальне значення для підтвердження стану пацієнтів із підозрою на агангліоз. Гістохімічне фарбування ацетилхолінестеразою широко використовується як допоміжний засіб для ідентифікації та типізації парасимпатичних нервів при біоптатах прямої кишки. Процес, який вимагає отримання заморожених тканин, є потенційно токсичним, а також трудомістким. Крім того, плями буває важко інтерпретувати, особливо у незрозумілих випадках. 3, 4 Вимоги до інтерпретації цього фарбування добре задокументовані фальшивими результатами, 4, 5, 6, 8, 9 фальшивими негативами, 18, 19, 20, 21, 22 та незрозумілими результатами 19, 22.

Ми виявили, що використання фарбування Diff Quik на заморожених тканинах підкреслює клітини гангліїв, фарбуючи їх цитоплазму яскраво-синім кольором. Фарбування є легкодоступним, недорогим і нетоксичним, і його можна наносити безпосередньо на заморожені зрізи тканин. Крім того, для цього не потрібні ніякі технічні знання. Контраст між яскраво-блакитним забарвленням у клітинах гангліїв та блідо-фіолетовим фарбуванням у решті тканин сприяє швидкій та легкій ідентифікації клітин гангліїв в інтраопераційному середовищі. При використанні разом із зафарбованими H- та E-слайдами плями Diff Quik діють як доповнення, скорочуючи час інтерпретації заморожених секцій.

На закінчення, ретельне обстеження декількох зрізів Н & Е, пов'язаних з ад'ювантними імуногістохімічними барвниками перифералін та S-100, виявилося високочутливим та специфічним методом для ідентифікації гангліозних клітин у всмоктувальних ректальних біопсіях. Під час дослідження ця діагностична точність підтримувалась у кількох патологоанатомів, що не займаються педиатрією. Цей протокол покращив лабораторну ефективність, оскільки серійні зрізи H&E вимагали менш ніж у 30% випадків. Крім того, не потрібно було рутинного пошуку заморожених тканин. Все це було досягнуто при збереженні 24-годинного часу повороту в 93% випадків.