предметів

реферат

Mycobacterium avium subsp. паратуберкульоз (MAP) та епітопи вірусу Епштейна-Барра (EBV) викликають стійку гуморальну відповідь у сироватці крові хворих на розсіяний склероз, але перехресна реактивність щодо гомологічного основного білка мієліну (MBP) та регуляторного фактора 5 інтерферону людини (IRF5) не була у спинномозковій спинній лікворі). Ми оцінювали сироватку крові та лікворну хворобу пацієнтів з РС та іншими неврологічними захворюваннями (OND) з гуморальною реакцією на пептиди EBV/MAP та IRF5/MBP. Наші дані показали, що пептиди EBV та MAP здатні індукувати специфічну гуморальну імунну відповідь у пацієнтів із РС порівняно з контролем OND у сироватці крові та лікворі. У хворих на РС спостерігали інтратекальний специфічний синтез IgG проти MBP та їх гомологічних EBV та MAP, на що вказує індекс антитіл. Гуморальна відповідь проти EBV, MAP, MBP та IRF5 була значно вищою у пацієнтів із РС порівняно з OND як сироватки, так і CSF. Більша присутність антитіл проти MBP та їх MAP та EBV, гомологічних у лікворі під час рецидивів, свідчить про можливу роль патогенів у посиленні запалення.

результат

Співвідношення CFS/сироваткового альбуміну та індекс посилань

Для всіх зразків індекс Link оцінювали як загальний маркер синтезу інтратекального IgG, співвідношення CSF/сироватковий альбумін (Q Alb) як маркер цілісності BBB та відсоток зразків з різними типами пошкодження BBB і показано в Таблиця 1. Статистично значущої шкоди у ВВВ не спостерігалось. Групи РС порівняно з іншими групами, про що свідчать індекс Link та коефіцієнт CFS/альбумін.

Стіл в натуральну величину

Еліза

Абс проти прихованих та літичних білків EBV EBNA1 та BOLF1, MAP та гомологічних пептидів людини контролювали у сироватці крові та CSF пацієнтів із РС та у контролях IND, NIND, UND 5. Абс проти EBNA1 400–413 було виявлено у 26 із 43 (60%) пацієнтів з РС, тоді як 3 із 17 (18%) контролів IND, 2 з 11 (18%) NIND та лише одна UND були позитивними в сироватці крові (AUC = 0,74, р = 0,001) (рис. 1А). У спинномозковій тяжці 17 із 43 (40%) РС, 3 із 33 (10%) ІНД, жоден з 11 пацієнтів з NIND та 5 UND (AUC = 0,80, p = 0,001) не був визнаний позитивним (рис. 1B) . Для MAP_106c 121–132 27 з 43 (63%) пацієнтів з РС, 4 з 17 (24%) IND, 4 з 11 (36%) NIND та 1 UND були позитивними (AUC = 0,73, p = 0, 008) у сироватці крові (рис. 1C), тоді як 23 із 43 (54%) пацієнтів з РС, 3 з 17 (18%) IND, 2 з 11 (18%) NIND та жоден з контрольних органів UND не відповіли на MAP_106c 121–132 у CSF (AUC = 0,71, p = 0,02) (рис. 1D). Позитивність до MBP 85-98 була виявлена ​​у 27 з 43 (63%) пацієнтів з РС, 5 з 17 (29%) IND, 4 з 11 (36%) NIND та лише одного UND у сироватці крові (AUC = 0, 71, p = 0,03) (рис. 1E). У спинномозковій тяжці серед хворих на РС ми спостерігали подібну ситуацію: 33% РС, 27% IND, 10% NIND та 0% пацієнтів з UND демонстрували позитивні показники MBP 85-98 (AUC = 0,7, p = 0,03) (рис. 1F ).

subsp

Сорок три пацієнта, сімнадцять IND, одинадцять NIND та 5 UND були протестовані на реактивність щодо EBNA1 400-413, MAP_0106c 121-132, MBP 85-98, сироватка ( A, C., Е ) та CSF. ( B, D, F ). Горизонтальні чорні смуги представляють середнє значення, тоді як значення p позначаються двома стрілками зі стрілками, які тануть у верхній частині кожного розподілу. Межі позитивності, розраховані за допомогою аналізу ROC, позначаються штриховими лініями.

Повнорозмірне зображення

Сорок три пацієнта, сімнадцять ІНД, одинадцять НІНД та 5 УНД були протестовані на реактивність щодо покритих сироваткою пластин BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 та IRF5 424-434 ( A, C., Е ) та CSF ( B, D, F ). Горизонтальні чорні смуги представляють середнє значення, тоді як значення p позначаються двома стрілками зі стрілками, які тануть у верхній частині кожного розподілу. Межі позитивності, розраховані за допомогою аналізу ROC, позначаються штриховими лініями.

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Кореляційний аналіз

Кореляційні аналізи проводили для визначення зв’язку між пептидною позитивністю. Ми виявили хорошу кореляцію з пептидом EBNA1 400-413 з гомологічним пептидом MAP_106c 121-132 у сироватці крові (R2 = 0,57; P 2 = 0,4; p

Розсіяний графік, що показує кореляцію між EBNA1 400-413 та MAP_0106c 121-132 у сироватці крові ( A ) у CSF ( B ). EBNA1 400-413 та MAP_0106c 121-132 із сироваткою MBP 85-98 ( C, E ) у CSF ( D, F ) у пацієнтів з РС. Кореляцію Пірсона розраховували, використовуючи Graph Pad 6.

Повнорозмірне зображення

Ми також виявили кращу кореляцію між Abs проти BOLF1 305-320 та MAP_4027 18-32 пептиду в CSF (R2 = 0,54; p

Розсіяний графік, що показує кореляцію між BOLF1 305-320 та MAP_4027 18-32 у сироватці крові ( A ) у CSF ( B ). BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 із сироваткою IRF5 424-434 ( C., Е ) у CSF ( D, F ) у пацієнтів з РС. Кореляцію Пірсона розраховували, використовуючи Graph Pad 6.

Повнорозмірне зображення

Конкурсний тест

Щоб продемонструвати перехресну реакційну здатність між MAP/EBV та самими епітопами, ми розробили два конкурентних аналізи: одне покриття MBP 85-98 на пластині та інше покриття IRF5 424-434 на пластині (рис. 5A, B, відповідно). Для аналізу конкуренції, покритого MBP 85-98 (рис. 5А), у всіх суб'єктів CSF (MS # 1, MS # 2 та IND) як EBNA1, так і MAP106 ефективно інгібували зв'язування антитіл з пептидом, покритим MBP. У конкурентному аналізі з IRF5 424-434 (рис. 5B), як BOLF1, так і MAP 4027 ефективно інгібували зв'язування з покриттям IRF5 424-434 у всіх суб'єктів CSF (MS # 1, MS # 2 та IND), тоді як контрольні пептиди MAP 2694 не спричиняти зменшення сигналу (рис. 5A, B). У сукупності ці результати показують, що Abs-анти-EBNA1 та анти-MAP106 націлені на один і той же конформаційний епітоп MBP, а також демонструють, що Abs-анти-BOLF1 та анти-MAP 4027, спрямовані на один і той же конформаційний епітоп IRF5, є перехресно реактивними в CSF.

Конкурсний тест з покритими MBP пластинами ІФА ( A ) та IRF5 ( B ). ( A ) СМЖ від 2 пацієнтів з РС та 1 IND попередньо інкубували протягом ночі із насичуючими концентраціями [10 мкМ] MAP2694 38-46 (негативний контроль), EBNA1 400-413, MAP 106 121-132 та MBP 85-98 (позитивний контроль), Перша колонка представляє звичайний пептид ІФА (1: 2 CSF у PBS-T). ( B ) Той самий СМЖ попередньо інкубували з MAP2694 38-46 (негативний контроль), BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 та IRF5 424-434 (позитивний контроль). Перша колонка представляє звичайний пептид ІФА (1: 2 CSF у PBS-T).

Повнорозмірне зображення

Індекс пептидного IgG специфічного антитіла (ШІ) у пацієнтів з РС

Індекс антитіл (AI) для всіх пацієнтів з РС розраховували за такою формулою AI = QlgG [специфікація]/Qlim 7. Висока кількість позитивних зразків проти відібраних пептидів у групі МС мала AI> 1, 5, що свідчило про внутрішньотекальну IgG-специфічну продукцію антитіл проти EBNA1 400–413, MAP 106, MBP 85–98 та BOLF1 305–320, MAP_4027 18– 32, пептиди IRF5 424-434, як показано в таблиці 4.

Стіл в натуральну величину

обговорення

Точність результатів підтверджена результатами кореляції, тим фактом, що у сироватці крові та лікворі виявлено потрійний позитив щодо BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 та IRF5 424-434 у пацієнтів з РС порівняно з відсутністю у IND/NIND/Піддослідні УНД підтвердили нашу гіпотезу про те, що MAP та EBV можуть запалити аутоімунний процес при РС, а позитивність до різних пептидів (EBNA1 400-413, MAP_106c 121-132 та MBP 85-98) в ЦСЖ може бути пов'язана з РС пацієнтів із рецидивом порівняно з пацієнтами з РС без рецидиву.

Матеріали і методи

предметів

пептиди

Синтетичні пептиди, отримані з антигенів EBV (BOLF1 305-320, EBNA1 400-413), антигени MAP (409-188, MAP_0106C 121-132) та гомологи людини (MBP 85-98, IRF5 424-434) були включені в дослідження 3, 4; пептиди комерційно синтезували (LifeTein, South Plainfield, NJ 07080 USA) з чистотою> 90% і зберігали замороженими в одноразових аліквотах [10 мМ] при -80 ° C.

ІФА

Змагальний тест

Дві MS та одну IND CSF піддавали ІФА на пластинах з покриттям MBP 85-98 або IRF5 424-434. Конкурентні аналізи проводили шляхом попередньої інкубації ліквору на ніч при 4 ° C з насичуючими концентраціями пептидів [10 мкМ] (MBP 85-98; EBNA1 400-413; MAP 106) та (IRF5 424-434; BOLF1 305-320, Sero - негативний пептид (MAP 2694) використовували як негативний контроль [10 мкМ], а ІФА ІФА, MBP 85-98 або IRF5 424-434 [10 мкМ] був позитивним контролем.

Індекс IgG-специфічних антитіл (ШІ)

Інтратекальний синтез EBNA1 400-413, MAP 106, MBP 85-98 та антитіл, специфічних до IgG BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 та IRF5 424-434, визначали за індексом антитіл (AI) 7, 19, 20. Дані нормалізували щодо сильного позитивного контролю, включеного у всі експерименти, реакційна здатність яких становила 10000 довільних одиниць (АС)/мл. Індекс антитіл, включаючи концентрацію альбуміну в сироватці крові та концентрацію ліквору, показав нормальний бар’єр крові/ліквору (QIgG [загальний обсяг]> Qlim) 7. Ми використовували наступну формулу: AI = QIgG [специфікація]/Qlim, оскільки з QIgG [специфікація] = IgGspec [CSF]/IgGs [сироватка] та Qlim 21 = 0,93 * √ (Qalb) 2 + 6 2 x 10 −6 - 1, 7 2 * 10 −3 7, 21 .

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 6.0 (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Значення P, які використовувались для порівняння різних категорій в одностроковому аналізі, були розраховані за допомогою U-критерію Манна-Уітні. Відмінності зі с