предметів

реферат

Головний

80% фолікулярної лімфоми дорослого типу за відсутності експресії білка BCL2. Нещодавно Мартін-Герреро та ін. описав періодичну втрату гетерозиготності при 1p36 та зв'язок з мутаціями TNFRSF14 у невеликої частини пацієнтів з фолікулярною лімфомою у дітей. 6

Порівняно, що походить від В-клітин центру післяродової пам'яті, дитяча лімфома вузлових периферійних зон має подібні архітектурні та імунофенотипові особливості з дорослим типом; однак помітна і характерна лімфома педіатричної вузлової крайової зони демонструє переважання чоловіків (приблизно 20: 1) і переважно локалізується в області голови та шиї. 7, 8 Ця лімфома є захворюванням стадії 1 і має чудовий прогноз та загальний низький рівень рецидивів. Повідомлялося про генетичні аномалії в периферичній зоні дитячих лімфовузлів, причому найпоширенішою зміною є трисомія 18 (17%), що також є поширеною цитогенетичною патологією, виявленою при лімфомі лімфоми дорослого типу. 10, 11 Як і у випадку фолікулярної лімфоми дитячого типу, остаточний діагноз лімфоми лімфовузлів у педіатричних зонах та відокремлення від подібних морфологічних утворень залишається проблемою.

Через тенденцію до певних перекриваються характеристик між педіатричним типом фолікулярної лімфоми та дитячою вузловою лімфомою крайової зони та відсутністю літератури, що описує генетичний ландшафт цих різних утворень, ми провели глибоке секвенування цілого екзома (> 140-кратне охоплення) у 10 справ. педіатричні лімфатичні вузли периферійної зони та фолікулярна лімфома дитячого типу, а також секвенування Сангера у двох інших випадках для характеристики значущого мутаційного значення цих рідкісних пухлин та пошуку додаткових мутацій драйверів та задіяних біологічних шляхів. Наш аналіз виявив нову рецидивуючу мутацію соматичної точки у дитячій фолікулярній лімфомі у факторі транскрипції фактор-регулятор інтерферону 8/консенсус-зв'язуючий білок інтерферону (IRF8/ICSBP), c.197A> G, що кодує p.Lys66Arg. Інші соматичні варіанти спостерігались у фолікулярної лімфоми педіатричного типу та лімфоми крайової зони педіатричного вузла, включаючи мутації в генах, що беруть участь у транскрипції, внутрішньоклітинній сигналізації та клітинній організації, хоча загальна частота несинонімічних мутацій, як правило, була низькою (4,6 мутації на випадок ).

Матеріали і методи

Вибір справи

Тематичні дослідження кафедри патології Медичного центру Стенфордського університету та дитячої лікарні Сіетла були розглянуті між 1996 і 2015 рр. Щодо випадків діагнозу лімфома крайової зони або фолікулярна лімфома у пацієнтів віком від 13 до 14 років. Коротше кажучи, ДНК витягували з фіксованої формаліном тканини. парафіну за допомогою наборів Qiagen DNeasy згідно з протоколами виробника. Система цільового збагачення Agilent SureSelect Exon V5 була використана для збагачення 51-Мб екзоми після секвенування платформи Illumina Hiseq 2500 V3 з використанням парного кінцевого сполучення 100 bp, з охопленням у режимі вихідного сигналу 200 × з довжиною зчитування 2 × 100 PE.

Вирівнювання, одинарний нуклеотидний варіант, варіант номера копії та аналіз Indel

Послідовність Sanger IRF8

Послідовність Сангера проводили для виявлення варіанту-кандидата IRF8 з праймерами, розробленими з використанням PrimerQuest; праймери перераховані в додатковій таблиці S1. Ампліфіковану ДНК секвенували та візуалізували за допомогою 4Peaks. 17

Багатовидове вирівнювання та прогнозування ефекту за допомогою одного варіанту нуклеотиду

Дані порівняння хребетних MULTIZ були отримані з браузера UCSC Genome, ідентифікатор звіту: hg38. Перекладені ділянки, що містять IRF8 екзон 1 і екзон 2, були вилучені та проаналізовані на збереження K66. Тривимірне моделювання гомології структури білка проводили за допомогою SWISS-MODEL, як описано. Використовували 18 алгоритмів передбачення PolyPhen-2 та SIFT, як описано вище. 19, 20

результат

Послідовність цілкомкомпонентних послідовностей та аналіз даних дитячої фолікулярної лімфоми та дитячої лімфоми периферичної зони у дітей

Щоб виявити потенційні мутації драйверів, а також охарактеризувати мутаційний ландшафт фолікулярної лімфоми дитячого типу та лімфоми крайової зони педіатричної вузлової області, ми провели цілковито глибоке секвенування (охоплення> 140 разів) у шести випадках фолікулярної лімфоми дитячого типу, з однією парою нормальних пухлин і чотирма випадками дитячої вузлової лімфоми крайової зони. У пацієнтів віком від 18 років і менше (діапазон: 12–18 років) були виявлені всі випадки фолікулярної лімфоми дитячого типу та лімфатичні випадки педіатричної вузлової крайової зони. Випадки були досліджені, а морфологічні та імунофенотипові ознаки підтвердили відповідні діагнози. Демографічні показники та клінічні ознаки пацієнтів детально описані в таблиці 1.

Стіл в натуральну величину

Використовуючи наш аналітичний конвеєр, що складається з трьох різних алгоритмів виклику варіантів, Mutect, SNPPET та VarScan, спостерігалося соматичне несинонімічне навантаження мутації на кожен випадок із середнім значенням 4,6 мутацій на випадок (діапазон 2-13). Щоб мінімізувати помилкові негативи, ми використовували більш м’які параметри фільтра, включаючи мінімальну частоту 10% алеля та вимогу охоплювати 10 зчитувань/охоплення одним нуклеотидом. Всього виявлено 46 несинонімічних соматичних мутацій, які впливають на 44 різні гени, включаючи мутації missense та nonsense мутації. 3 Щодо дитячої фолікулярної лімфоми ми виявили 32 однонуклеотидні варіанти в генах, які беруть участь у транскрипції, внутрішньоклітинній сигналізації та проліферації клітин (табл. 2). Менше мутацій було виявлено у дитячої лімфоми з вузловою крайовою зоною, при цьому 14 варіантів нуклеотидів спостерігали у генах, що беруть участь у адгезії клітин, регуляторних елементах цитокінів та проліферації клітин (табл. 3).

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Для фолікулярної лімфоми педіатричного типу ми ідентифікували рецидивуючу мутацію соматичної точки c.197A> G, що кодує p.Lys66Arg, у факторі транскрипції фактора інтерферону-фактора 8/консенсусно-зв'язуючому білку інтерферону (IRF8/ICSBP). Цей унікальний варіант одного нуклеотиду був ідентифікований у трьох із шести зразків дитячої фолікулярної лімфоми (табл. 2). Відповідний зразок нормальної тканини з випадку 1 відсутній. Секвенсинг Сангера підтвердив варіанти однонуклеотидних у всіх трьох випадках. Ми також провели секвенування Сангера для виявлення варіанта IRF8 для решти випадків дитячої фолікулярної лімфоми, усіх випадків дитячих вузлових лімфатичних зон у периферійній зоні та 22 випадків фолікулярної лімфоми дорослого типу; ці випадки були негативними щодо c.197A> G у IRF8 (дані не наведені). У дитячої лімфоми крайової зони педіатричних вузлів не спостерігалося повторних соматичних мутацій.

IRF8 є членом сімейства транскрипційних факторів IRF, переважно експресується в клітинах імунної системи, яка є членом складних регуляторних мереж, що сприяють диференціюванню кровотворення, регуляції клітинного циклу та апоптозу. Білок IRF8 містить N-кінцевий ДНК-зв'язуючий домен і C-кінцевий домен асоціації IRF. Зміна p.Lys66Arg є консервативним нейтральним зарядовим заміщенням залишку в ДНК-зв'язуючому домені IRF8 (рис. 1а та b): конкретно петля 2, яка є С-кінцем до альфа-спіралі-2 (рис. 1b). Вважається, що воно потрапляє в область довгої петлі, однак ця позиція, заснована на екстраполяції високо гомологічного члена сімейства IRF4 та кристалічній структурі комплексу PU.1/IRF4/ДНК, впливає на взаємодію ДНК-білок шляхом заміщення більша група. Крім того, оцінка збереження амінокислотної послідовності в IRF8 у положенні 66 показала 100% ідентичність послідовності порівняно з 97 видами хребетних з асоційованими геномами (рисунок 1c та додаткова таблиця S2). Крім того, PolyPhen2 та алгоритми сортування нетерпимих до толерантних (SIFT) передбачають шкідливий ефект зміни p.Lys66Arg.

вивчення

Повторна точкова мутація в ДНК-зв'язуючому домені IRF8. ( a ) Принципова схема білка IRF8 з визначенням домену зв'язування ДНК та домену асоціації IRF. Зірочки вказують місце та кількість випадків заміни K66R. ( b ) Стрічкова модель ДНК-зв'язуючого домену з візуалізованою бічною ланцюгом R66. Вбудована модель смуги з послідовністю дикого типу. c ) Багатовидова композиція IRF8, що включає екзон 1 і екзон 2 (амінокислоти 1-87) з посиленим консервативним лізином у позиції 66 у багатьох видів.

Повнорозмірне зображення

Копіювати варіанти чисел та виявлення синтезу

Номер копії та/або структурні зміни часто пов’язані з гематолфоїдними новоутвореннями. Ми оцінили набір парних кінців для дитячої фолікулярної лімфоми та лімфоми дитячих вузлових лімфовузлів, щоб визначити зміни в кількості копій та геномному зрощенні та точках зупинки. Ми використовували CNV-seq для ідентифікації змін кількості копій ДНК шляхом збільшення або зменшення в 2 рази порівняно з контролем. Оскільки не всі зразки мали спарену нормальну тканину, всі зразки порівнювали з парними гістологічно підтвердженими невиявленими лімфатичними вузлами (нормальна тканина) з випадку 1. У цьому аналізі не було виявлено рецидивуючих хромосомних ділянок, що вказували б на значні зміни кількості геномних копій. у фолікулярної лімфоми дитячого типу або лімфоми крайової зони педіатричного вузла.

Ми використовували описаний раніше програмний інструмент Fusion та алгоритм переліку хромосомних транслокацій для виявлення геномних перестановок. Цей високочутливий і специфічний метод використовує дані послідовності послідовності ДНК для швидкого виявлення транслокацій, інверсій та великих делецій. Три структурні варіації були виявлені в трьох окремих випадках фолікулярної лімфоми педіатричного типу (Додаткова таблиця S3): два варіанти - це делеції, що містять каппа імунної глобуліни та область приєднання змінної області (випадки 4 та 6), а третя - делеція у важкій частині імуноглобуліну ланцюжок змінної області (випадок 1). Ці делеції, ймовірно, представляли собою нормальні перебудови гена важкої ланцюга імуноглобуліну та гена каппа імуноглобуліну (Таблиця 1). У дитячій фолікулярній лімфомі не виявлено злиття генів. У дитячій вузловій лімфомі крайової зони не виявлено транслокацій, інверсій або делецій.

Порівняння з варіантами фолікулярної лімфоми у дорослих та вузлової лімфатичної зони периферичної зони для дорослих

Враховуючи схожі морфологічні та фенотипові характеристики фолікулярної лімфоми дитячого типу та лімфоми крайової зони педіатричної вузлової зони з відповідними типами дорослих, ми прагнули порівняти виявлені варіанти однонуклеотидних з опублікованими повідомленнями про зміни фолікулярної лімфоми дорослого та дорослого типу. вузлова крайова зона лімфоми. Мутацій фолікулярної лімфоми педіатричного типу в елементах регуляції хроматину (CREBBP, EZH2, KMT2D (MLL2), членах сімейства TNF (TNFRSF14), сигналах NF-κB або mTORC1 не спостерігалося; 25, 26, 27, 28, однак, Випадок 2, який також містив мутацію IRF8, мутацію фактора транскрипції PAX5, p.Gly183Ala. Ця мутація не спостерігалась у спарених нормальних тканинах, тоді як ця мутація PAX5 раніше не публікувалася у фолікулярної лімфоми дорослого типу. в G183 були виявлені у пацієнтів з В-лімфобластним лейкозом

обговорення

На відміну від фолікулярної лімфоми дорослого типу, яка має характерну хромосомну транслокацію BCL2, а також інші загальні хромосомні та генні зміни, генетична основа розвитку фолікулярної лімфоми педіатричного типу чітко не визначена. 32 Мартін - Герреро та ін. Нещодавно вони повідомили про неодноразову втрату гетерозиготності на рівні 1p36 - місця, яке зазвичай змінювалося при фолікулярній лімфомі дорослого типу, що в основному асоціювалося з мутаціями TNFRSF14. Також повідомлялося про 6 мутацій EZH2 в тій самій когорті, що забезпечує певну підтримку потенційних генетичних механізмів, як і доросла форма. Нещодавно IRF8 був описаний як періодично мутований ген у невеликому відсотку випадків фолікулярної лімфоми дорослого типу. Варіанти були переважно розташовані в С-кінцевому домені IRF8 з незрозумілими функціональними наслідками, і не повідомлялося про повторні зміни нуклеотидів. Ідентифікація специфічної заміни p.Lys66Arg у значній частині когорти фолікулярних лімфом дитячого типу значною мірою вказує на загальну та критичну зміну, яка призводить до розвитку захворювання. Крім того, хоча подібний ген задіяний між дорослими та педіатричними формами, неодноразові зміни в ДНК-зв'язуючому домені припускають потенційно унікальне походження захворювання.

Нещодавно було описано, що взаємодія між IRF8 та IRF4 відіграє роль регулятора при зараженні вірусом Епштейна-Барра. 41 IRF8 і IRF4 безпосередньо взаємодіють з N-кінцевим доменом антитіла до вірусного антигену Епштейна-Барра 3С, яке кодується вірусом Епштейна-Барра, і утворює молекулярний комплекс, який стабілізує IRF4 і призводить до дезаградації IRF8, що залежить від протеасом. Зворотний зв’язок між експресією IRF8 та стійкістю до апоптозу через опосередкований Fas шлях описаний як корелюючий із підвищеною стійкістю до апоптозу та метастатичним потенціалом in vitro. Враховуючи зв'язок між інфекцією EBV та зміненою активністю IRF8 з розвитком та трансформацією декількох лімфопроліферативних розладів, цікаво припустити, що IRF8 є критичним ланкою в лімфомагенезі багатьох порушень кровотворення.

Крім того, ми виявили мутацію фактора транскрипції PAX5/BSAP, p.Gly183Ala. Ця амінокислота, G183, була визначена як важливий залишок, мутований у випадках В-лімфобластного лейкозу. На підставі функціональних досліджень, мутації G183 впливають на транскрипційну активність PAX5 та змінюють сприйнятливість до неоплазії. Тому не дивно, що ця мутація може додатково вплинути на прогресування та генез фолікулярної лімфоми дитячого типу. Ці мутації не було у відповідній нормальній тканині, а також не спостерігалося в інших випадках фолікулярної лімфоми педіатричного типу або лімфоми педіатричної вузлової крайової зони.

Як і у випадку фолікулярної лімфоми дитячого типу, генетична основа дитячої лімфоми вузлового краю недостатньо відома. Ріццо та ін. Вони повідомили про 21% випадків дитячих лімфатичних вузлів у периферійних зонах, які містили генетичні зміни, виявлені шляхом флуоресценції in situ гібридизації та ПЛР зворотної транскрипції. Провідною аномалією була трисомія 18 (17%), яка була описана при лімфомі крайової зони вузликового типу у дорослого типу. Наша когорта не продемонструвала жодних змін у кількості копій для підтримки трисомії. Однак у випадку AMOTL1 ми виявили соматичний варіант дитячої лімфоми з вузловою крайовою зоною, яка також бере участь у патогенезі лімфоми крайової зони селезінки. Цей висновок свідчить про те, що хоча педіатрична лімфома крайової зони вузлів та лімфовузлів дорослого типу можуть поділяти деякі загальні генетичні відхилення, наша когорта генетично відрізняється від лімфоми лімфоми дорослого типу.

На відміну від нашої дитячої фолікулярної когорти лімфоцитів, повторна соматична мутація у наших випадках дитячих лімфовузлів у вузловій крайовій зоні не була виявлена ​​шляхом секвенування всієї екзоми. Оскільки мутаційне навантаження було відносно нижчим у педіатричній вузловій крайовій смузі лімфоми, ніж у фолікулярної лімфоми педіатричного типу (3,25 мутації на випадок проти 4,8 мутацій на випадок), це може свідчити про те, що захворювання може не мати спільного та специфічного провідника. Однак останні дослідження показують, що соматичні мутації в некодуючих регіонах можуть містити потенційні мутації драйверів, і навіть синонімічні зміни в генах, що кодують білок, можуть відігравати функціональну роль у розвитку пухлини. 43, 44, 45 Крім того, нещодавно було показано, що модифікація епігенетичного ландшафту фолікулярної лімфоми дорослого типу шляхом мутацій метилтрансферази KMT2D (MLL2) є пролімфомагенною; можливість того, що некодуючі мутації ДНК або епігенетичні зміни можуть призвести до дитячої вузлової лімфоми з периферійної зони, вимагає подальшого вивчення. 46

Загалом, це перший опис широкого ландшафту соматичних мутацій дитячої фолікулярної лімфоми та лімфоми педіатричної вузлової крайової зони. Дані підтверджують інший механізм розвитку порівняно з відповідною хворобою дорослого типу, оскільки типової країни мутації, виявленої у вузликових крайових вузлах дорослого типу та лімфомах крайової зони дорослого типу, не було. Крім того, була виявлена ​​одиночна рецидивуюча точкова мутація IRF8 у підгрупі випадків фолікулярної лімфоми педіатричного типу, які, як вважалося, мають шкідливий ефект. Враховуючи функціональну роль IRF8 у В-клітинах та транскрипції, цікаво припустити, що ця мутація може служити рушійною силою у розвитку водія.