біалельними

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • Предмети та методи
  • предметів
  • Абсолютно відмінна послідовність
  • Контрольований мутагенез повного філаміну С
  • Культура клітин та імунофлюоресценція
  • Вестерн-блот-аналіз та послідовна екстракція білків миючим засобом
  • імуногістохімія
  • результат
  • обговорення

предметів

  • Генетичні дослідження
  • Секвенування нового покоління

реферат

У переважної більшості педіатричних хворих з розширеною кардіоміопатією специфічна етіологія невідома. Дослідження з родинами з розширеною кардіоміопатією ілюструють роль генетичних факторів у кардіоміопатичній етіології. У цьому дослідженні ми застосували абсолютно відмінне секвенування для членів роз'єднаної сім'ї, ураженої раніше не повідомленим вродженим синдромом розширеної кардіоміопатії, що вимагає ранньої трансплантації серця. Аналіз ексомоми виявив гетерозиготні варіанти сполуки в гені FLNC. Гістологічний аналіз серцевого м’яза показав значні саркомерні та міофібрилярні аномалії, а імуногістохімічне фарбування показало наявність агрегатів Філаміну С у серцевих міоцитах. Ми робимо висновок, що біалельні варіанти FLNC можуть спричинити вроджену дилатаційну кардіоміопатію. Оскільки супутні клінічні ознаки хворих на хворих виражені слабо і їх легко не помітити, слід розглянути тестування FLNC у дітей з розширеною кардіоміопатією. .

Предмети та методи

предметів

a ) Сімейний родовід, що демонструє вік особин та сегрегацію мутантних алелів FLNC. Алель дикого типу FLNC позначений знаком плюс. Заповнені символи позначають постраждалих людей. Діагональні лінії через символи позначають померлого. b ) Еволюційне збереження домену FLNC, який містить варіант помилки F106L (червоний), у різних хребетних (порівняння та захист хребетних, порівняння та захист умов, браузер генома UCSC). c ) Електроферограми, що показують мутації FLNC у пацієнта та їх батьків. Повна кольорова версія цього зображення доступна в Інтернеті в European Journal of Human Genetics.

Повнорозмірне зображення

Абсолютно відмінна послідовність

Виділення геномної ДНК, збагачення екзоми, секвенування та аналіз були завершені, як описано вище. 3 варіанти були відфільтровані для створення остаточного списку лише рідкісних функціональних варіантів (міссенс, нісенітниця, варіанти сайтів зрощування та індекси). Видалено варіанти з нижчою частотою алелів> 0,01 на сервері Exome Variant (випуск ESP6500) або варіанти з кількістю алелів> 150 у базі даних європейських зразків ExAC (NFE). Аналіз валідації та сегрегації проводили, як описано. 3 варіанти були оцінені щодо еталонних послідовностей, що зберігаються у Національному центрі біотехнологічної інформації (FLNC: NM_001458.4). Варіантні дані були подані до ClinVar (SUB1474516; //www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).

Контрольований мутагенез повного філаміну С

Клон кДНК у повний зріст для FLNC (NM_001458.4) з N-кінцевим тегом Myc-DDK був отриманий від OriGene (Rockville, MD, США). Мутагенез, спрямований на сайт, проводили для генерування клонів з варіантами p.F106L, p.R991 *, використовуючи набір сайт-спрямованого мутагенезу QuikChange II XL відповідно до рекомендацій виробника (Stratagene, Санта-Клара, Каліфорнія, США) та конкретних олігонуклеотидів ( c.318C> G, стор. (F106L), вперед - 5'-GCCCTCGAGTTgCTCGAGCGCGA-3 'і зворотний - 5'-TCGCGCTCGAGcAACTCGAGGGGC-3'; для c.2971C> T, стор. (R991 *), вперед - 5 ' -CTGGGGGGA 3 'і назад - 5'-GCCAGCCCCTCaTGTGTTCACAG-3'; для F106L-s, 5'-ATGAGCACCAAGTGCG-3 '; Введення правильного варіанту та відсутність інших варіантів було підтверджено секвенуванням Сангера.

Культура клітин та імунофлюоресценція

Вестерн-блот-аналіз та послідовна екстракція білків миючим засобом

Клітини нуклеофікували по 2 мкг кожної плазміди та аналізували у присутності білка через 48 годин після трансфекції. Для екстракції білка культивовані клітини двічі промивали 1 x PBS і лізували в буфері RIPA (100 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 150 мМ NaCl, 10 м EDTA, 1% дезоксихолату натрію, 1% Triton X -100, 0, 1% SDS), доповнений повним коктейлем інгібітора протеази без EDTA та PhosStop EASYpack (Roche). Клітинні лізати центрифугували при 13000 g протягом 5 хвилин і супернатант зберігали. Концентрацію білка оцінювали методом біцинхонінової кислоти (Pierce BCA Protein Assay Kit, Waltham, MA, USA). Білки запускали на 8% гелях SDS-PAGE, переносили їх у мембрани нітроцелюлози, блокували 5% сухого знежиреного молока в буфері TBS-T (20 мМ Трис (рН 7, 4), 150 мМ NaCl, 0,05% Твін-20) і інкубували протягом ночі при 4 ° C з наступними первинними антитілами: анти-DDK-антитілом (Cell Signaling, Беверлі, МА, США) та анти-актином (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США). Первинні антитіла виявляли за допомогою кон'югованих з пероксидазою хрону видоспецифічних вторинних антитіл (Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, USA) або Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)) із субстратом Luminata Forte Western HRP (Millipore, Billerica, MA, USA ). ) за допомогою LAS-300 FUJIFILM (Токіо, Японія).

імуногістохімія

результат

Порівняльне дослідження геномної гібридизації не показало жодних змін у кількості копій. Крім того, всю послідовність екзоми проводили на пробанді, його 16-річній медсестрі та їх батькам. Секвенування проводили за допомогою Illumina HiSeq 2500 (Сан-Дієго, Каліфорнія, США) для отримання парних результатів 150 bp із середнім покриттям 95 ×. Точні результати були проаналізовані для всіх схем успадкування і виявили гетерозиготну сполуку міссенсу та варіанти зупинки в гені FLNC: g. [128471009C> G]; [128484099C> T]. Перший варіант помилки, c. [318C> G], с. (F106L), згідно з базою даних ExAC (//exac.broadinstitute.org), був знайдений чотири рази у 32 261 європейців і передався у спадок від матері. Фенілаланін у цій позиції є дуже консервативним в процесі еволюції (рис. 1b) (GERP + = 4, 5, phyloP100way = 3, 2, 5, 6), і, як передбачалося, він буде втручатися в усі передбачені алгоритми, що досліджуються (SIFT, Polyfen2, LRT, VariantTaster, VariantAssessor, FATHMM). Другий варіант, c. [2971C> T], с. (R991 *) - це варіант із зупинкою/безглуздістю, який ще не вказаний у жодній базі даних і переданий від батька. Встановлено, що варіанти в FLNC відокремлюються, як очікувалося в сім'ї. Аналіз зразка померлої ДНК побратима виявив однакову гетерозиготність сполуки для варіантів FLNC (рис. 1а та в).

Оскільки гетерозиготні варіанти в FLNC були пов’язані з міофібрилярними та дистальними міопатіями, 7, 8, 9, 10, 11, неврологічну оцінку проводили у всіх членів сім’ї, які виявились варіантними носіями (сім суб’єктів; вік 5–72) років. Неврологічні обстеження та ехокардіограми були нормальними для всіх предметів.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Нарешті, ми рекомендуємо розглянути тестування на Філамін С. у дітей з розширеною кардіоміопатією. Рання молекулярна діагностика важлива для прогнозування, лікування та профілактики швидко прогресуючої серцевої недостатності та аритмій, що загрожують життю.