сітківки

  • реферат
  • Головний
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Приготування суспензії екстракту чорниці та ендотоксину
  • Тварини та лікування
  • електроретинограма
  • Імуноблот-аналізи
  • Вимірювання довжини зовнішнього відрізка
  • Кількісна RT-PCR в режимі реального часу
  • Вимірювання АФК
  • Статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Захисна дія екстракту лохини, насиченого антоціаном, на зорову функцію під час ЕІУ
  • Підтримання рівня родопсину за допомогою екстракту чорниці, багатого антоціаном, під час EIU
  • Інгібуючий ефект насиченого антоціаніном екстракту лохини на активацію STAT3, що викликається сітківкою, за допомогою EIU
  • Придушення прозапального цитокіну багатим антоціаном екстрактом чорниці в сітківці за допомогою EIU
  • Зменшення оксидативного стресу за рахунок екстракту чорниці, багатого антоціанінами, на сітківці
  • Придушення NF-kB B багатим антоціаном екстрактом чорниці в сітківці за допомогою EIU
  • ОБГОВОРЕННЯ

реферат

Головний

Останні технологічні досягнення призвели до синтезу корисних з медичної точки зору хімічних сполук. З іншого боку, існує тривалий історичний прецедент для розвитку наркотиків із живих істот, часто у формі рослинних екстрактів. Наприклад, дигіталіс, серцевий препарат, вперше з’явився у листі квітки дигіталісу (Digitalis purpurea L.) 1, а морфій, знеболюючий засіб, був виявлений у опійному маку (Papaver somniferum L.). 2

Тут ми зупинимося на їстівних ягодах, чорниці (Vaccinium myrtillus L.), які містять багаті антоціани. Антоціани - це водорозчинні глікозиди антоціанів, які є похідними катіонів флавілію. У чорниці є 15 різних антоціанів. 3 Попередні звіти свідчать про те, що антоціани є відповідальними молекулами за основні фармацевтичні ефекти чорниці, включаючи антиоксидантну активність, 4, 5, 6 та її здатність поглинати вільні радикали. 7 Екстракт чорниці, багатий антоціаном, здавна є популярним засобом лікування різних захворювань очей. Наприклад, вважається, що це поліпшення нічного зору, для якого проводились клінічні випробування. 8 Цей екстракт також запобігає катаракті та глаукомі. 9 Однак ступінь його впливу на зорову функцію та основні біологічні механізми не з’ясована.

Надмірний окислювальний стрес руйнує тканини при різних захворюваннях, включаючи нейродегенеративні захворювання, такі як бічний аміотрофічний склероз, 10 серцево-судинних захворювань, 11 та рак. 12 Хвороби очей, включаючи вікову дегенерацію жовтої плями13, також є наслідком окисного стресу, спричиненого перевиробництвом активних форм кисню (АФК). Оскільки антиоксидант, екстракт чорниці, багатий антоціанами, може впливати на захист тканин, він може мати фармацевтичне застосування в профілактичному лікуванні людей.

Раніше ми показали, що деякі молекули рослинного походження можуть запобігати або полегшувати пошкодження сітківки: лютеїн запобігає дисфункції нервів, а ресвератрол запобігає дисфункції судин сітківки на мишачій моделі ендотоксин-індукованого увеїту (EIU). 14, 15 У цій моделі вроджений імунітет викликає погіршення зорової функції, що можна побачити за допомогою електроретинограми (ЕРГ), 15, 16, 17 та аномальної адгезії лейкоцитів, що пов'язано з порушенням циркуляції, спричиненою запальними цитокінами, що продукуються в сітківці 18 ERG цих мишей показує порушення функції фоторецепторних клітин, що пов'язано з надмірною деградацією родопсину, зорового агента, що залежить від STAT3. 17, 19

У цьому дослідженні ми виявили біологічний вплив екстракту чорниці, багатого антоціаном, на зорову функцію мишей EIU, а також на його молекулярний механізм. Наші висновки підтверджують можливе подальше використання цього екстракту як профілактичної терапії.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Приготування суспензії екстракту чорниці та ендотоксину

Екстракт лохини (що містить близько 39% антоціанів), наданий Wakasa Seikatsu (Кіото, Японія), суспендований у сольовому розчині, забуференному фосфатом (PBS), у концентрації 50 мг/мл. Ліпополісахарид (LPS) від Escherichia coli 055: B5 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) розчиняли в PBS у концентрації 1 мг/мл.

Тварини та лікування

Мишей C57BL/6 (віком 6 тижнів) було придбано у CLEA Japan (Токіо, Японія) та поміщено в приміщення з кондиціонером (23 ± 1 ° C) у циклах темряви/12 годин світла (світло з 8:00) до 20: 00), з безкоштовним доступом до стандартної їжі (CLEA Японія) та водопровідної води. Мишей випадковим чином поділяли на три групи. Миші були багаті екстрактом чорниці, багатим антоціаном (500 мг/кг маси тіла) для групи лохини або PBS для контрольної групи та групи носіїв. Мишам вводили перорально протягом 4 днів. Через 3 години після останнього введення групи носія та лохини отримали одну внутрішньочеревну ін'єкцію LPS (6,0 мг/кг маси тіла) для створення моделі EIU, тоді як PBS вводили контрольній групі. Мишей оцінювали 1,5 (для вимірювання фосфорильованого NF-κB) та 24 (для інших) год після ін'єкції LPS або PBS, коли очевидні патологічні зміни в сітківці. 15, 20 Всі експерименти на тваринах проводились відповідно до заяви ARVO щодо використання тварин в офтальмологічних та візіонерських дослідженнях.

електроретинограма

Мишей пристосовували до темряви щонайменше 12 годин, їх готували при слабкому червоному світлі та знеболювали 70 мг/кг маси тіла натрію пентобарбіталу (Dainippon Sumitomo Pharmaceutical, Осака, Японія). Під час експерименту їх поміщали на грілку. Студенти отримували одну краплю суміші 0,5% тропікаміду та 0,5% фенілефрину (Santen Pharmaceutical, Осака, Японія). Заземлений електрод поміщав голку підшкірно в хвіст, а електрод порівняння - у рот. Активними електродами були золоті дроти, розміщені на рогівці. Були зроблені записи (PowerLab System 2/25; AD Instruments, NSW, Австралія), а реакції диференційовано посилювались та фільтрувались через цифровий смуговий фільтр в діапазоні від 0,313 до 1000 Гц для отримання α- та β-хвиль. Імпульси світла тривалістю 800 кд · с/м 2 і 4 мс постачали комерційним стимулятором (система Ганцфельда SG-2002; LKC Technologies, Гейтерсбург, штат Медіка, США). Опір електрода перевіряли до і після кожного вимірювання на всіх тваринах, використовуючи вбудовану функцію приладу. Час за замовчуванням α- і β-хвиль вимірювали від початку подразника до піку кожної хвилі. Амплітуду a-хвилі вимірювали від базової лінії до жолоба a-хвилі, а амплітуду b-хвилі - від жолоба a-хвилі до піку b-хвилі.

Імуноблот-аналізи

Вимірювання довжини зовнішнього відрізка

Сітківки (10 мкм) фіксували у 4% параформальдегіді та фарбували гематоксиліном та еозином (ВІН), а довжину зовнішнього сегмента (ОС) вимірювали в задній сітківці у чотирьох точках, двох з обох боків зорового нерва на відстані 200 і 500 мкм за допомогою ImageJ і усереднено. Всі зрізи досліджували під мікроскопом, оснащеним цифровою камерою (BIOREVO BZ-9000, Keyence, Осака, Японія).

Кількісна RT-PCR в режимі реального часу

Сітківку поміщали в реагент TRIzole (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) для вилучення загальної РНК. Комплементарну ДНК (кДНК) готували шляхом додавання 1 мкг загальної РНК до високопродуктивної РНК-k-кДНК Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США) та зворотної транскрипції відповідно до інструкцій виробника. Рівні родопсину, інтерлейкіну-6 (IL-6) та TNF-α мРНК нормалізувались до рівнів мРНК GAPDH. ПЛР проводили за допомогою системи ПЛР StepOnePlus у реальному часі (Applied Biosystems), а метод дельта-дельта-КТ використовували для кількісної оцінки експресії генів. Були використані наступні ген-специфічні праймери: родопсин вперед: 5'-GCTTCCCTACGCCAGTGTG-3 'і зворотний: 5'-CAGTGGATTCTTGCCGCAG-3'; il-6 вперед: 5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3 'і назад: 5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3'; tnf-a вперед: 5'-ACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3 'і назад: 5'-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3'; і розрив вперед: 5'-TGTCTTCACCACCATGGAGA-3 'і назад: 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3'.

Вимірювання АФК

Протокол вимірювання АФК базувався на опублікованому методі 22 з деякими модифікаціями. Очі енуклеювали і негайно заморожували в ОКТ (Sakura Finetek, Торранс, Каліфорнія, США). Нефіксовані кріосекції (10 мкм) інкубували з 5 мкМ дигідроетидієм (DHE; Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR, USA) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. DHE реагує з внутрішньоклітинним супероксидним аніоном і перетворюється в ядро ​​червоного флуоресцентного з'єднання етидію. Зрізи досліджували за допомогою мікроскопа, обладнаного цифровою камерою (BIOREVO BZ-9000, Keyence), за однакових умов експозиції, а інтенсивність фарбування у внутрішньому плексиформному шарі (INL) вимірювали в задній сітківці в чотирьох точках, дві на по обидві сторони зорового нерва. 200 і 500 мкм один від одного, використовуючи ImageJ і усереднено.

Статистичний аналіз

Значення виражали як середнє значення ± sd. Для оцінки статистичної значущості відмінностей використовували неспарений t-тест Стьюдента. P

Захисна дія екстракту лохини, насиченого антоціаном, на зорову функцію під час ЕІУ. Репрезентативні відповіді окремих мишей у кожній групі ( a ). Зменшення амплітуди хвилі ( b ) та b-хвилі ( c ) під час ЕІУ був суттєво пригнічений екстрактом чорниці, багатим антоціаном. Час хвилі за замовчуванням не змінився ( d ). Подовження імпліцитного часу b-хвилі під час EIU запобігло багатий антоціаном екстракт чорниці ( e ). * P ** P

Підтримання рівня родопсину за допомогою екстракту чорниці, багатого антоціаном, під час EIU. Імуноблот-аналіз ( a, b ). Зниженню вмісту білка родопсину під час ЕІУ запобігав багатий антоціаніном екстракт чорниці. * P ** P 14

Інгібуючий ефект насиченого антоціаніном екстракту лохини на активацію STAT3, що викликається сітківкою, за допомогою EIU

У сітківці ока зниження рівня родопсину корелює з активацією STAT3 із запаленням. 16, 17 Імуноблот-аналіз показав, що активований STAT3 підвищується під час ЕІУ, і це збільшення пригнічується багатим антоціаном екстрактом чорниці (рис. 3). Таким чином, активація STAT3 негативно корелювала з рівнем родопсину.

Інгібуючий ефект насиченого антоціаніном екстракту лохини на активацію STAT3, що викликається сітківкою, за допомогою EIU. Імуноблот-аналіз ( a, b ). Активований STAT3 оцінювали шляхом вимірювання pSTAT3. Збільшення pSTAT3 під час ЕІУ було значно запобігано лікуванням багатим антоціаном екстрактом чорниці. * P ** P

Придушення прозапального цитокіну багатим антоціаном екстрактом чорниці в сітківці за допомогою EIU. ПЛР у режимі реального часу. Рівні мРНК IL-6 були регульовані в сітківці ока з використанням моделі EIU і пригнічувались екстрактом чорниці, багатим антоціаніном. * P 23 Червона флуоресценція, що представляє АФК, була підвищена в моделях GCL, INL та ONL сітківки в моделях EIU; однак цю зміну запобігло обробка екстрактом чорниці, багатим на антоціани (Рисунок 5).

Зменшення окисного стресу за допомогою екстракту чорниці, багатого антоціанінами, на сітківці. Репрезентативні цифрові зображення зрізів сітківки, що реагували з DHE у кожній групі ( a ). Інтенсивність флуоресценції вимірювали за допомогою ImageJ і усереднювали ( b ). Збільшення флуоресценції DHE під час EIU було придушене багатим антоціаном екстрактом чорниці. ** P 24, який може бути в протилежному напрямку до IL-6. Ми виміряли фосфорильований p65, компонент активованого NF-κB, в сітківці після індукції EIU за допомогою імуноблот-аналізу. Рівень активованого NF-κB був підвищений в сітківці під час ЕІУ; однак воно було суттєво пригнічене дією екстракту лохини, багатого антоціаніном (рисунок 6).

Як у гомозиготних, так і у гемізиготних мишей-нокаутів родопсину клітини фоторецепторів втрачаються у зрілому віці. Стійкий дефіцит родопсину через тривале запалення згодом може спричинити дегенерацію клітин фоторецепторів. Отже, багатий антоціаном екстракт чорниці може зіграти певну роль у запобіганні цій пізній нейродегенерації. З практичної точки зору запалення в моделі EIU не триває довше 10 днів, 17, 28, що може бути причиною того, що апоптозу не спостерігається.

Зниження родопсину було пов’язано з активацією STAT3 та експресією IL-6. Наше попереднє дослідження показало, що зниження рододину, асоційоване зі STAT3 під час запалення, зумовлене механізмом посттранскрипції, який ми виявили надмірною деградацією в системах убиквітину та протеасом. 17, 19 Активований STAT3 індукує E3-убиквутин-лігазу Ubr1, що збільшує деградацію родопсину під час запалення, а АФК може модифікувати білок родопсину, що прискорює убиквітінацію та подальшу деградацію. Ми також спостерігали, що рівні мРНК родопсину не змінювались в умовах контролю або під час запалення, незалежно від лікування екстрактом лохини, насиченого антоціаніном (дані не наведені), відповідно до участі посттранскрипційної модифікації. Тому в поточному дослідженні, ймовірно, той самий механізм підвищеної деградації буде пояснювати знижений рівень родопсину. Екстракт лохини, багатий антоціаніном, пригнічує активацію STAT3 та вироблення АФК, що, можливо, запобігло опосередковану UPS деградацію родопсину.

Хоча STAT3 може активуватися різними типами лігандів, це дослідження показало, що одним із кандидатів на його активацію в запальній сітківці був IL-6. Насправді, як відомо, IL-6 експресується в гліальних клітинах Мюллера 29, що індукує подальшу активацію STAT3. Екстракт чорниці, багатий антоціаніном, міг діяти, блокуючи цей порочний цикл локальної сигналізації IL-6-STAT3 в сітківці. На відміну від цього, рівень TNF-α, іншого прозапального цитокіну, у цьому дослідженні не змінився (дані не наведені).

Окислювальний стрес є основним пусковим механізмом місцевого запалення та пошкодження тканин під час запальних процесів. 19 DHE використовується для виявлення аніону супероксиду, що утворюється в різних біологічних системах in vivo та in vitro. Нещодавно було виявлено, що DHE може також реагувати з іншими окислювачами, такими як H 2 O 2 та ONOO. Таким чином, червона флуоресценція DHE під час запалення сітківки може свідчити про кілька видів АФК, накопичених у сітківці. Більшість з 15 антоціанів, що містяться в чорниці 3, доставляються недоторканими до ока або сітківки живих тварин. 31, 32 Ці попередні висновки підтверджують ідею про те, що всередину антоціани у цьому дослідженні потрапили в сітківку мишей EIU, де вони безпосередньо захопили АФК.

Активований NF-κB був збільшений в сітківці, де АФК накопичувався за рахунок ЕІУ, і пригнічувався після зменшення АФК екстрактом чорниці, багатим антоціаніном, що свідчить про те, що дією екстракту на цей чутливий до окислювально-відновного відновлення фактор транскрипції була модуляція АФК як антиоксидант. Цільовий ген NF-κB включає IL-6, що підтверджує ідею про те, що ефект насиченого антоціаніном екстракту чорниці на активацію STAT3 був придушенням ROS-індукованої осі NF-κB-IL-6.

Цікаво, що багатий антоціаніном екстракт чорниці інгібує активність ангіотензинперетворювального ферменту (АПФ) в ендотеліальних клітинах судин завдяки своїй здатності зв’язувати та хелатувати Zn в активному місці АПФ. 33 Ангіотензин II високо регулюється під час запалення сітківки, а шлях активації рецептора ангіотензину II типу-STAT3 також сприяє зменшенню родопсину під час запалення. Таким чином, багатий антоціаном екстракт чорниці може пригнічувати зниження родопсину, модифікуючи цей сигнал про ангіотензин II. Відомо, що ангіотензин II стимулює місцеву експресію генів білків, пов’язаних із метаболізмом заліза 34, що може посилити регуляцію транспортерів іонів та полегшити засвоєння заліза. Перевантаження залізом призводить до окисного пошкодження 35, тому багатий антоціаном екстракт чорниці може інгібувати цей шлях, щоб захистити клітини фоторецепторів від окисного стресу. Таким чином, багатий антоціаніном екстракт чорниці може інгібувати безліч шляхів сітківки для захисту зорової функції.

Протягом останніх чотирьох десятиліть базові та клінічні дослідження екстракту чорниці, багатого антоціаном, були активізовані через потенційну користь для здоров'я. 8, 36 Однак детальний молекулярний (і) механізм (и) дії цього екстракту вимагає подальших досліджень in vivo та in vitro. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що багатий антоціаном екстракт чорниці має протизапальну та антиоксидантну дію in vivo. Отримані нами результати можуть сприяти майбутньому розвитку нових терапевтичних підходів до захисту зорових функцій під час запалення сітківки.