предметів

реферат

Ентеральне харчування коров’ячим молоком пов’язане з некротизуючим ентероколітом новонароджених (НЕК) та сепсисом. Дієтична сенсибілізація антигену може зіграти певну роль у стимулюванні та/або підтримці запалення в обох станах. Для дослідження специфічних цитокінових реакцій на білок коров'ячого молока (CMP) у недоношених дітей з НЕК та сепсисом, 14 немовлят з НЕК, 14 консенсусних здорових контролерів та 10 септичних контролів. Нестимульовані та стимульовані мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), що секретують IFN-γ, IL-4, IL-10 та TGF-β1, підраховували за допомогою одноклітинного імуноферментного аналізу (ELISPOT). Під час гострої фази НЕК пацієнти продемонстрували загальну картину високих рівнів секреції цитокінів, коли їх не стимулювали та не стимулювали мітогени [фітогемаглютинін (PHA)] та CMP: бета-лактоглобулін (β-Ig) та казеїн. Ці відповіді були більш вираженими на β-Ig для IFN-γ, IL-4 та IL-10, ніж TGF-β1. Відповіді цитокінів при сепсисі були нижчими, ніж при НЕК (найнижчі у здорових контролерів з мінімальною реакцією TGF-β1). З часом індукували нижчі частоти цитокіносекретуючих клітин, ніж під час гострої фази, за винятком клітин, що секретують TGF-β1, які збільшувались із часом (у відповідь на PHA та CMP) переважно після НЕК, а також після сепсису.

реакції

Головний

Некротизуючий ентероколіт новонароджених (НЕК) та сепсис є одними з найпоширеніших ускладнень у НІКУ (1). В обох випадках частота захворювання є обернено пропорційною вазі народження та ГА (2). НЕК - гетерогенна група кишкових захворювань, що включає цілий ряд клінічних проявів та різний ступінь запалення кишечника (3). Патогенез НЕК вважається багатофакторним, але до кінця не вивчений. Виявлено кілька факторів, що схильні до розвитку, включаючи передчасне споживання, годування молоком, кишкову гіпоксію/ішемію та транслокацію бактерій. НЕК зазвичай виникає у недоношених дітей (4), які також особливо схильні до сепсису (5).

Більшість випадків НЕК спостерігаються у дітей, які харчуються ентерально. Характер ентерального корму видається важливим патогенним фактором. Епідеміологічні дослідження свідчать про підвищений ризик розвитку НЕК у немовлят, які харчуються коров’ячим молоком, порівняно з тими, хто отримує грудне молоко (матері або донора) (6). Потенційний зв’язок між НЕК та молоком на основі молока досі в основному досліджували шляхом виявлення імунопротективних елементів у грудному молоці та визначення впливу типу молока (суміш або грудне молоко) на розвиток кишкового мікробіозу (7). Бета-лактоглобулін (β-Ig), який, як відомо, зазвичай не існує в грудному молоці людини, становить 8,5% білкового складу білків коров'ячого молока (CMP), тоді як казеїни становлять 80% CMP (8).

Хоча імунна система недоношених дітей вважається відносно "незрілою" порівняно з імунною системою дорослих немовлят, недоношені діти можуть належним чином реагувати на антигенні подразники. Однак мало відомо про імунологічну реакцію цих дітей на дієтичні антигени (9), або у "здоровому" стані, або, що, що ще важливіше, при захворюваннях, які можуть включати слизовий бар'єр, такий як НЕК та сепсис.

Раніше ми продемонстрували сенсибілізацію до CMP у дітей з НЕК, де in vitro стимуляція мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) казеїном та β-Ig індукувала ефекторну відповідь обох типів Т-хелперних клітин (Th): Th1 (IFN-γ) ) і Th2 (IL). -4 та 5) (10).

У цьому дослідженні ми використовували метод чутливих ферментних імуноспотів (ELISPOT), який дозволяє виявляти секрецію цитокінів на рівні одиничних клітин, і додатково досліджували це явище. Оцінювали дітей з НЕК, здорових людей контролю та немовлят із сепсисом. Окрім повторного вивчення секреції IFN-γ та IL-4, ми також охарактеризували регуляторні цитокіни IL-10 (секретуються регуляторними клітинами Th типу 1) та TGF-β1 (секретуються Th3) за допомогою PBMC. Крім того, ми повторили всі оцінки на той час, коли новонароджені одужали від НЕК та сепсису, порівняно зі здоровими контролями, щоб виміряти зміни у відповіді цитокінів з часом.

ПРЕДМЕТИ І МЕТОДИ

Предмети.

Тридцять вісім недоношених новонароджених, які потрапили до НІКУ в лікарні Челсі та Вестмінстер з лютого 2006 р. По серпень 2007 р., Були прийняті до трьох дослідницьких груп: 14 недоношених новонароджених із НЕК [модифікований Белл (11) ступінь II: вісім випадків та ступінь III: шість випадків] які були ідентифіковані та отримані протягом 24 годин після постановки діагнозу; 14 здорових контрольних пацієнтів без анамнезу НЕК чи сепсису, які були індивідуально скориговані для паралельного відбору для віку після зачаття (PCA) та післяпологового віку (PNA) порівняно з пацієнтами з NEC; та 10 новонароджених із пізнім початком (віком> 1 року) позитивного посіву крові на сепсис (септичний контроль), що відповідає, хоча і не окремо, PCA та PNA пацієнтам з NEC та здоровим контролем.

Ізоляція PBMC.

При встановленні діагнозу, а потім у терміні, у немовлят у трьох групах було відібрано приблизно 0,5 мл гепаринізованої крові. PBMC виділяли центрифугуванням з градієнтом щільності із застосуванням стандартних процедур. Клітини промивали в повному середовищі (R10), що містить RPMI 1640 7 (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Gillingham, UK), 50 од/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину, 10 мкг/мл гентаміцину, 2 мМ глутаміну, натрію. піруват, 10 ммоль буфера 4- (2-гідроксиетил) -1-піперазинетансульфонової кислоти (HEPES) та 10% інактивованого тепловою енергією FCS. Концентрацію PBMC визначали за допомогою лічильника частинок Z1 (Beckman Coulter, High Wycombe, UK). Відсоток життєздатних клітин визначали шляхом секреції трипанового синього.

Покрийте пластину захоплюючими антитілами.

Дно нітроцелюлозного мікропланшетного титра (MAIPS 4510; Millipore, Ватфорд, Великобританія) попередньо змочували 20 мкл/лунку 70% етилового спирту протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Спирт декантирували і лунки тричі промивали 200 мкл PBS і покривали цитокінспецифічним моноклональним антитілом захоплення в 100 мкл PBS (1 мкг/лунка для IFN-γ, IL-4 та IL-10 та 0,3 мкг/лунка ). для TGF-β1). Платівку інкубували принаймні протягом ночі та до 1 тижня при 4 ° С у закритому мішку. Безпосередньо перед використанням неадсорбоване антитіло зливали, а лунки тричі промивали PBS і блокували 200 мкл/лунку R10 протягом 2 годин при 37 ° C у зволоженій атмосфері 5% CO 2.

Інкубація PBMC.

Блокуюче середовище декантирували і додавали РВМС по 0,5 х 105 клітин на лунку в трьох примірниках для кожного стимулу. Клітини інкубували протягом 20-24 годин в атмосфері 5% CO 2, при 37 ° C за відсутності або присутності відповідних антигенів або мітогенів: гемоціанін у замковій свердловині (KLH; 500 мкг/мл), β-Ig (500 мкг/мл), казеїну (500 мкг/мл) та фітогемагглютиніну (PHA; 10 мкг/мл; Sigma Chemical Co.-Aldrich).

Виявлення клітин, що секретують цитокіни.

Штамби промивали шість разів PBS, що містив 0,05% Твін 20 (200 мкл/лунка; Sigma Chemical Co.). 0,4 мкм відфільтрованого біотинільованого цитокінспецифічного моноклонального антитіла (MAb) додавали в 100 мкл об'ємів/лунку (0,1 мкг/лунку, розбавляли в PBS/0,5% BSA) та інкубували протягом 4 годин при кімнатній температурі.

Захоплення та виявлення MAb на IFN-γ та IL-4 було отримано від MAbtech AB (Nacka Strand, Швеція), тоді як антитіла до IL-10 від BD Biosciences (Сан-Дієго, Каліфорнія) та на TGF-β1 (Ab: захоплення рекомбінантної людської химери TGF-βRII/Fc та біотинільованих анти-TGF-β1 антитіл) були отримані з R&D систем (Великобританія). Наприкінці інкубаційного періоду лунки промивали шість разів PBS/0,05% Твін 20 та додавали 100 мкл авідин-біотин-пероксидазного комплексу (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA), підготовленого відповідно до інструкцій виробника. 1-2 години при кімнатній температурі. Лунки тричі промивали 200 мкл PBS/Tween 20, потім три рази 200 мкл PBS і, нарешті, до кожної лунки додавали 100 мкл субстрату аміноетилкарбазолу (AEC) (Sigma Chemical Co.-Aldrich). Пляма розвивалася при кімнатній температурі протягом 4 хвилин перед промиванням водопровідною водою та сушінням протягом ночі. Плями підраховували за допомогою планшетного зчитувача ELISPOT (Carl Zeiss, Welwyn Garden City, Великобританія). Кінцеві результати виражали у вигляді забарвлених клітин (SFC) на 105 PBMC.

Статистика.

Дані в кожній з трьох груп перевіряли на нормальність розподілу та виявляли непараметричні. Різні набори аналізів вивчали чотири відмінності у відповіді на цитокіни в кожній групі як гостро, так і в термін. Результати виражаються як медіана та інтерквартильний діапазон (IQR) для кожної групи або як число та відсоток. Порівняння між немовлятами з НЕК та здоровими контролями аналізували як парні дані (парний тест Вілкоксона) як для порівняння між терміновими та гострими зразками. Порівняння з септичними дітьми не збігалися (тест Манна-Уітні). Рівень суттєвості був встановлений на рівні 1%; лише р сепсис; р сепсис; р сепсис; 4-10 разів; р збільшення у 5 разів; Фіг. 1).

Підвищення частоти виділення PBMC - цитокінів у пацієнтів з НЕК, септичним контролем та здоровим контролем (AELISPOT) після стимуляції p - Ig при презентації (гостро) та у термін (термін). Частоти клітин, що секретують IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) та TGF-β1 (D), виражаються як AFCS при 105 MNC (ASFC при 105 PBMC), що представляє різницю між середня кількість плям у лунках, оброблених антигеном, та лунках у нестимульованих лунках на кожному етапі відбору проб. Кожен рядок представляє одну тему. * p сепсис, 3-5-кратний; р збільшення у 5 разів; Фіг. 2). Стимуляція KLH індукувала незначну відповідь у всіх зразках (НЕК, сепсис та здорові контролі при презентації та в термін для чотирьох оцінених цитокінів).

Підвищення частоти цитокінів, що секретують PBMC, у пацієнтів з НЕК, септичним контролем та здоровим контролем (AELISPOT) після стимуляції казеїном, при презентації (гостро) та у термін (термін). Частоти клітин, що секретують IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) та TGF-β1 (D), виражаються як AFCS при 105 MNC (ASFC при 105 PBMC), що представляє різницю між середня кількість плям у лунках, оброблених антигеном, та лунках у нестимульованих лунках на кожному етапі відбору проб. Кожен рядок представляє одну тему. * p β-lg